Notch3胞內活化片段抑制小鼠胸腺上皮細胞系增殖

李瀟涵， 閔玉嬌， 潘子輝， 吳皓杰， 王薈， 邵啟祥

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

胸腺屬于中樞免疫器官，是T細胞發育、成熟的重要場所。但嚴重感染、腫瘤放化療等破壞胸腺微環境，導致胸腺上皮細胞(thymic epithelial cells，TECs)凋亡，胸腺細胞遷出不可逆減少，從而引起胸腺急性萎縮[1]。目前胸腺萎縮機制仍不清楚，因此闡明胸腺萎縮機制，將對嚴重感染、移植排斥反應等引起的T細胞免疫缺陷的重建具有重要的理論意義和臨床價值。

以往的研究表明，胰島素、性激素等多種激素可能是引起胸腺萎縮的主要因子[2-3]。但最近的研究顯示，胸腺細胞上過表達Jagged1會導致TECs凋亡[4]，提示Notch信號很可能也參與了胸腺萎縮的發生。小鼠出生后，Notch3主要表達于胸腺的髓質區，且其表達高于Notch1，Notch3介導的Notch信號也較Notch1強[5-6]，因此我們推測Notch3的激活導致胸腺上皮細胞凋亡的可能性比Notch1更大。本研究通過在小鼠TECs系mTEC1細胞中過表達Notch3胞內活化片段(intracellular domain of Notch3,NICD3)，探討Notch3信號的激活對TECs的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

EdU Apollo?567細胞增殖檢測試劑盒(廣州銳博生物科技公司)；DMEM培養液(以色列BioInd公司)；胎牛血清(Life Technologies Corporation)；牛血清白蛋白(BSA，湖州英創生物科技有限公司)；Lip2000(美國Invitrogen公司)。

1.2 細胞培養

1.3 慢病毒表達載體的構建

在基因庫中查詢Notch3基因(NM_008716.2)，顯示NICD3位于其DNA序列的第5 049～7 016位，共計1 968 bp。按照該序列經生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成包含EcoR Ι和BamH Ι酶切位點的NICD3的DNA序列。

構建方法如下：將合成的NICD3互補的DNA片段退火酶切后插入PSTB-Flag-GFP慢病毒載體，將載體轉化感受態大腸埃希菌DH5α，并經過37 ℃ 250 r/min 搖床擴增2 h，然后涂板(具有氨芐西林抗性)培養12～16 h、挑取單個菌落，接種培養12～16 h，最后提取NICD3慢病毒載體，通過酶切與測序驗證慢病毒載體是否構建成功。

1.4 NICD3表達載體感染mTEC1細胞

NICD3處理組和空載組均按照目的質粒(NICD3質粒或空載質粒)：pMD2G：psPAX2=3 μg ∶1 μg ∶2 μg的比例加入至200 μL無血清DMEM培養液，再與含有Lip2000(18 μL)的無血清DMEM(200 μL)培養液混勻，然后均勻滴入到培養有HEK-293T細胞(匯合度在70%左右)的60 mm培養皿中(內含4 mL無血清DMEM培養液)，培養24 h(更換新鮮培養液)和48 h后收取含病毒的上清液并過濾，再將過濾好的病毒液與含10%胎牛血清的DMEM按1 ∶1混勻，加入到培養有mTEC1細胞的60 mm小皿中，培養24 h后(第1次感染)更換新鮮的含病毒上清液的混合液進行共培養，再培養48 h后(第2次感染后24 h)使用熒光顯微鏡觀察有無綠色熒光并拍照記錄，再于同一視野的可見光下觀察細胞密度并拍照記錄，慢病毒感染成功的mTEC1細胞胞質可見綠色熒光，發綠色熒光細胞數/可見光細胞數量×100%即為感染效率。然后采用嘌呤霉素進行篩選，并使用熒光顯微鏡觀察篩選后細胞形態以及發綠色熒光的細胞數占總細胞數的比例。

1.5 EdU法檢測細胞增殖率

將NICD3和空載對照病毒感染后的mTEC1細胞和未感染的mTEC1細胞均按5×103/孔接種于96孔細胞培養板中，檢測前2 h更換為含EdU的無血清DMEM(1 ∶1 000)培養液，繼續培養2 h，PBS漂洗2次，采用4%低聚甲醛固定30 min，再以2 mg/mL甘氨酸孵育5 min終止固定，PBS漂洗5 min、0.5% Triton X-100孵育10 min；將Apollo染液以100 μL/孔加入到細胞培養板，避光孵育30 min；棄凈染液，再經過TritonX-100孵育10 min、細胞核染色(Hoechst)30 min、PBS漂洗3次(5 min/次)后，于熒光倒置顯微鏡下觀察發紅色熒光的增殖期細胞數以及發藍色熒光的總細胞數，細胞增殖率=增殖期細胞數/總細胞數×100%。

1.6 統計學方法

所有實驗數據采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05判斷為有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建慢病毒表達載體

使用EcoR Ι和BamH Ι對構建的PSTB-NICD3-Flag-GFP進行酶切鑒定，驗證NICD3的DNA片段是否正確插入慢病毒表達載體(圖1)，結果顯示質粒經過酶切后目的條帶位于2 000 bp左右，與預期結果一致，表明NICD3正確插入載體，最后采用測序確認目的基因序列完全正確。

M：標準參照物；1：經過酶切的質粒；2：未經過酶切的質粒

2.2 慢病毒表達載體成功轉染mTEC1細胞

將包裝后的慢病毒載體感染mTEC1細胞，第2次感染之后24 h通過熒光顯微鏡觀察并經計算NICD3慢病毒載體的感染效率約為20%(圖2A)。使用嘌呤霉素進行篩選的過程中，與空載組相比，可能由于NICD3影響了mTEC1細胞的生長，導致感染NICD3慢病毒后的mTEC1細胞(NICD3組)生長緩慢、細胞細長、排列疏松、胞質顆粒較多(圖2B)。所以后續實驗直接采用第2次感染后24 h即未經過嘌呤霉素篩選的mTEC1細胞檢測細胞增殖率。

A：篩選前；B：篩選后

2.3 過表達NICD3可抑制mTEC1細胞增殖

EdU增殖實驗結果顯示，與空白組和空載組比較，NICD3感染組的mTEC1細胞增殖明顯受到抑制(圖3)。使用GraphPad軟件對3次實驗結果進行統計學分析顯示，NICD3感染組(NICD3)細胞增殖率約為40%左右，明顯低于空載組和空白對照組(P<0.01)，說明NICD3過表達可抑制mTEC1細胞增殖。

3 討論

Notch信號通路主要由Notch受體、Notch配體和CSL轉錄調節因子3部分組成，參與細胞生長發育的多個過程[7]。脊椎動物中有4種Notch受體(Notch 1～4)和5種Notch配體(Jagged1,2和Delta-like1,3,4)。Notch受體和Notch配體均位于細胞表面，均為單次跨膜糖蛋白，當配體與受體結合后，Notch受體經過2次裂解釋放出NICD，NICD進入細胞核后，改變CSL的構象，使CSL對Notch靶基因的抑制轉為激活，從而調節下游Hes1、Hey、Deltex1等基因的轉錄[8]。

以往的研究多集中在胸腺中Notch信號對T細胞發育的作用，例如Notch信號對TCR的表達以及胸腺細胞發育分化的影響，而對Notch信號在TECs中的作用研究相對較少[9-12]。

4種不同的Notch受體被激活后可能發揮不同的作用[5]。研究表明Notch2在所有人體造血干細胞以及T細胞發育過程中穩定低表達。Notch4相對局限于活化的巨噬細胞、胰腺細胞等，而在胸腺中很少表達[13]。研究發現Jagged1可誘導TEC退化，而Notch3在出生后表達上調，因此我們推測Jagged1可能主要通過Notch3介導TECs的衰老和退化。

我們在前期實驗中已經證實Notch信號的活化可對mTEC1細胞產生影響[14]，因此本研究中我們采用NICD3慢病毒載體轉染mTEC1細胞，觀察活化的Notch3信號對TECs的影響，結果表明Notch3信號的活化可抑制mTEC1細胞的增殖。而相關研究表明胸腺退化萎縮時胸腺微環境會發生改變，胸腺上皮細胞的生長發育常常受到影響，胸腺微環境的破壞最終導致胸腺細胞遷出不可逆減少[1,15]，并且這種減少臨床上很難重建。我們的實驗結果提示阻斷胸腺上皮細胞的Notch3信號有可能促進胸腺上皮細胞的增殖，從而延緩胸腺萎縮的發生，為后期研究Notch3信號調控TECs衰老和退化的分子機制提供了參考資料，并可能為臨床防治嚴重感染、移植排斥反應等導致的T細胞免疫缺陷提示了方向。

但NICD3進入細胞核以后通過激活哪些靶基因來進行調節目前仍不清楚。有研究表明Notch信號下游靶基因Hes1的激活可抑制細胞增殖[16]。那么在過表達NICD3的mTEC1細胞中Hes1是否也發揮了重要作用，仍需要進一步研究。