PIK3CD-AS1對腎癌細胞增殖和凋亡的影響

錢洲楠， 張金虎， 王誠悅， 周洋， 焦志敏， 何宜晨， 殷喜豐， 孫浩， 陳兵海

(江蘇大學附屬醫院泌尿外科， 江蘇 鎮江 212001)

腎細胞癌是泌尿生殖系統惡性腫瘤中較為常見的一種，在成人惡性腫瘤中所占比例較高，而且我國的腎癌發病率正逐年遞增[1-3]。腎癌的病因尚未明確[4]，且起病隱匿，無臨床癥狀，多由健康體檢時發現[5]，而這些患者占腎癌患者總數的50%甚至60%以上。近30%的腎癌患者在確診時已經發生癌細胞的轉移[6-7]，目前治療腎癌最主要的方法仍然是腎臟的根治性手術切除。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腎癌患者經各種方法治療后的5年生存率分別為92%、86%、64%、23%[8]，但即便經外科根治術治療后，仍有部分患者有發生復發轉移的可能，可見腎癌的早期診斷意義重大[9]。因此，探討腎癌發病的分子機制并發掘可用于腎癌早期診斷、治療及預后評估的分子靶標成為當務之急。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)功能強大，在表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控以及蛋白質代謝等各個水平均具有不可替代的作用[10-11]，因而影響著多種生物學過程。其機制主要涉及對基因表達水平的調控，并且于正常細胞和惡性腫瘤細胞中存在差異表達。目前已知有大量LncRNA參與惡性腫瘤的發生、演變和進展，有的LncRNA表達可以促進癌變，有的LncRNA表達則可以抑制癌變[12-13]。

cBioPortal for Cancer Genomics(cBioPortal，http：∥www.cbioportal.org)是一個惡性腫瘤相關基因組數據探索、可視化及分析的平臺，有助于在惡性腫瘤組織以及細胞學的相關研究中獲得分子學相關數據以及理解遺傳、表觀遺傳、基因表達和蛋白質組學數據[14]。我們通過cBio Cancer Genomics Portal分析了LncRNA PIK3CD-AS1的臨床特征，發現其與腎癌的分期和轉移可能有關，但其確切的功能和分子機制尚未明確。

本研究通過熒光定量PCR、細胞轉染、細胞增殖及凋亡實驗、基因表達譜芯片等方法來探討PIK3CD-AS1在腎癌細胞中的表達狀況及其對腎癌細胞增殖和凋亡的影響，并尋找可能存在的與其相互作用的關聯基因。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株(HK-2、769-P、786-O、A498)由江蘇大學附屬醫院中心實驗室保存；1640培養基購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清(南京福麥斯生物有限公司)；RNA抽提試劑盒(上海超研生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒(南京昂杰斯生物科技有限公司)；SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；PCR前后引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PIK3CD-AS1過表達載體及G418藥物(上海北諾生物科技有限公司)；CCK-8增殖實驗試劑盒(翊圣生物科技公司)；凋亡試劑盒(南京福麥斯生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及qRT-PCR檢測PIK3CD-AS1 復蘇正常腎小管上皮細胞HK-2和腎癌細胞769-P、786-O和A498。4種細胞用含有10% 胎牛血清的1640培養基置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞密度達到90%時，將4種細胞進行消化，采用RNA抽提試劑盒，提取總RNA，對總RNA的產量、質量行純度分析，使D(280 nm)/D(260 nm)比值為1.8～2.1。按反轉錄說明書在20 μL體系中加入2 μg總RNA，反應條件為 37℃ 15 min，85 ℃ 5 s生成cDNA，稀釋10倍體積。隨后進行qRT-PCR，以cDNA為模板，按20 μL體系加入相應試劑進行擴增，每個待測樣本設置3～6個重復樣本，加入PIK3CD-AS1前后引物(上游：5′-AGCAGTAAACCTTCCCCTCC-3′；下游：5′-TCTTGAACCCCACCAGACTC-3′)進行qRT-PCR，以GAPDH作為內參。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。采用2-△△Ct法計算各組細胞PIK3CD-AS1/GAPDH比值。實驗重復3次。

1.2.2 過表達載體的轉染及過表達細胞的篩選 選取PIK3CD-AS1表達最低的且處于對數生長期的769-P細胞，經細胞計數，按1.5×105個/孔密度接種于12孔板上，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的1640培養基于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。24 h后待細胞匯合度達到80%～90%，按照 Lipofectamine 2000轉染試劑說明書將PEGFP-N1-PIK3CD-AS1質粒轉染入769-P細胞，作為實驗組。同時以PEGFP-N1質粒作為陰性對照組，以未轉染的769-P作為空白對照組。轉染24 h后，細胞以1 ∶10比例傳代至另一塊12孔板，待其均貼壁展開后加入終濃度為300 μg/mL的G418進行細胞株的篩選。2周后挑取單個陽性克隆細胞并接種于96孔板中，繼續培養7～8 d，使用熒光顯微鏡逐一觀察熒光，有綠色熒光蛋白表達的為陽性克隆細胞。將陽性克隆細胞傳入12孔板進行培養，待其長滿后重復篩選挑取克隆3次，逐漸依次傳入24孔板、12孔板、6孔板，最后傳入大培養皿中擴大培養。經G418多次篩選后，提取各組細胞總RNA，并反轉錄合成cDNA，以GAPDH作為內參，進行qRT-PCR，所得數據用2-△△Ct法計算各組細胞PIK3CD-AS1/GAPDH比值，實驗重復3次。

1.2.3 CCK-8法檢測過表達PIK3CD-AS1后腎癌細胞的增殖 將經篩選好的實驗組及陰性對照組細胞消化后，分別取100 μL細胞懸液接種至96孔板，設置濃度梯度為1 000～10 000細胞/孔，每1 000細胞為一梯度，將其放在培養箱中24 h(37 ℃、5%CO2)后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，繼續在培養箱(37 ℃、5%CO2)中孵育1～4 h，分別于1、2、3及4 h時通過酶標儀檢測D(450 nm)值。后選取3 000細胞/孔培養1 h進行重復。細胞增殖活力(%)=[D(實驗組)-D(空白組)]/[D(陰性對照組)-D(空白組)]×100。

1.2.4 流式細胞術檢測過表達PIK3CD-AS1后腎癌細胞的凋亡 將實驗組細胞及陰性對照組細胞分別傳至6孔板，培養箱中孵育24 h(37 ℃、5%CO2)后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，預冷的PBS清洗2次，250 μL結合緩沖液重懸細胞，調整濃度為1×106/mL，取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/Alexa Fluor 647和20 μg/mL的碘化錠溶液10 μL，混勻后于室溫避光孵育15 min，在反應管中加400 μL PBS，流式細胞儀(FACS)進行分析。

1.2.5 凋亡相關基因表達譜芯片 分別抽提實驗組及陰性對照組細胞總RNA，反轉錄得到總cDNA，行凋亡相關基因表達譜檢測。根據熒光定量PCR試劑說明書，分別加入待測86種凋亡相關基因以及兩種內參的前后引物及其他組分，形成20 μL混合體系，采用標準兩步法行qRT-PCR，檢測各凋亡相關基因的表達。實驗重復3次。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PIK3CD-AS1在腎癌細胞中的表達

以HK-2中PIK3CD-AS1表達水平為100%，769-P中PIK3CD-AS1表達水平較HK-2下降到(1.21±1.04)%，差異有統計學意義(t=165.096，P<0.01)。786-O中PIK3CD-AS1表達水平較HK-2下降到(21.98±18.34)%，差異有統計學意義(t=7.037，P<0.05)。A498中PIK3CD-AS1表達水平較HK-2下降到(32.53±30.39)%，差異有統計學意義(t=3.846，P<0.05)。由此可見，PIK3CD-AS1在腎癌細胞中的表達較正常腎臟細胞明顯降低，尤其是769-P最為明顯。見圖1。

a：P<0.01，b：P<0.05，與HK-2比較

2.2 PIK3CD-AS1穩定高表達細胞株的鑒定

在熒光顯微鏡下可見，轉染成功的陽性克隆細胞有綠色熒光，見圖2。通過qRT-PCR檢測，陰性對照組細胞中PIK3CD-AS1表達水平較空白組細胞下降到(60.07±32.96)%，差異無統計學意義(t=2.098，P>0.05)。實驗組細胞中PIK3CD-AS1表達水平較空白組細胞上升(40.51±15.64)倍，差異有統計學意義(t=-4.376，P<0.05)。見圖3。

圖2 熒光顯微鏡下觀察PIK3CD-AS1的轉染情況

a：P<0.05，與空白組比較

2.3 PIK3CD-AS1過表達抑制腎癌細胞的增殖

CCK-8法檢測結果顯示，實驗組細胞的增殖活性較對照組細胞下降到(44.45±12.88)%，差異有統計學意義(t=-10.562，P<0.05)。見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較

2.4 PIK3CD-AS1過表達促進腎癌細胞的凋亡

經流式細胞儀分析，實驗組細胞的凋亡率為(15.43±1.33)%，對照組細胞的凋亡率為(10.03±0.65)%，兩者差異有統計學意義(t=-6.34，P<0.05)，見圖5。

圖5 流式細胞術檢測兩組細胞的凋亡率

2.5 PIK3CD-AS1引起腎癌細胞凋亡相關基因表達譜改變

在凋亡相關基因表達譜芯片篩選實驗中，經3次重復實驗證實，數據結果以實驗組細胞較對照組細胞的基因相對表達倍數表示，舍棄無效數據，選擇3倍以上或者1/3倍以下為表達明顯上調或者下調的基因。結合文獻我們選擇其中部分基因進行再次驗證，結果發現基因DFFA、BCL2L1、CASP9有顯著差異，其中實驗組細胞DFFA、BCL2L1表達比對照組明顯下降，而CASP9的表達明顯增高，見圖6。

圖6 過表達PIK3CD-AS1腎癌細胞中DFFA、BCL2L1、CASP9表達量

3 討論

LncRNA在惡性腫瘤的發生、發展中發揮著廣泛的作用及影響。Zhang等[15]研究發現，SPRY4-IT1表達水平與腎細胞癌的組織學分級、腫瘤分期、淋巴結轉移、遠處轉移有關；在786-O細胞中干擾SPRY4-IT1的表達，可以明顯減慢細胞生長、阻滯細胞生長周期并促進細胞的凋亡。Zhang等[16]還發現，在腎癌組織和細胞中MALAT-1表達水平比癌旁正常腎臟組織和正常腎小管上皮細胞HK-2中顯著增高；同時，MALAT-1表達高低與腫瘤大小、分期、淋巴結轉移相關，而與患者性別、年齡、組織學分級、遠處轉移無關。我們對腎癌患者數據庫的研究發現，PIK3CD-AS1在較多腎癌患者中表達異常，且與腎癌的發生發展存在著一定關聯。本研究結果顯示腎癌細胞中PIK3CD-AS1的表達較正常腎臟細胞顯著下降，PIK3CD-AS1過表達后腎癌細胞增殖活力明顯下降，而凋亡率明顯升高。說明PIK3CD-AS1可抑制腎癌細胞的增殖并促進凋亡。

研究發現多種lncRNA與腎癌的凋亡存在密切關系。Chiyomaru等[17]研究顯示，在細胞株786-O和ACHN中，miR-141可抑制HOTAIR表達，從而使惡性腫瘤細胞的凋亡增多。Xue等[18]通過siRNA敲低LncRNA NBAT-l表達后，腫瘤細胞增殖活性明顯提高，流式細胞儀顯示細胞凋亡明顯減少。本研究顯示，PIK3CD-AS1可以增加腎癌細胞的凋亡，且其促凋亡很可能與CASP9、DFFA、BCL2L1基因相關。細胞凋亡在動物發育和組織穩態中起著核心作用，負責執行凋亡的基本機制是半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族。CASP9(即caspase-9)是公認的細胞凋亡的啟動因子，CASP9等凋亡因子激活后細胞凋亡的啟動達到高峰[19-20]；我們的結果表明CASP9在PIK3CD-AS1高表達腎癌細胞中表達明顯上升。DFFA也被稱為caspase激活DNA酶的抑制劑(ICAD)，可抑制細胞凋亡，DFFA在部分惡性腫瘤(如漿液性卵巢癌[21]、食管癌[22])中的表達明顯上調；而我們發現DFFA在PIK3CD-AS1高表達腎癌細胞中表達顯著下降。BCL2L1的主要功能是阻止BAX(或BAK1)的激活，從而阻止細胞凋亡[23-24]；我們的結果顯示BCL2L1在PIK3CD-AS1高表達腎癌細胞中表達顯著下降。由此可見PIK3CD-AS1可能通過與CASP9、DFFA、BCL2L1的相互作用從而加快腎癌細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結果表明PIK3CD-AS1在腎癌的發生、發展中有重要作用，可作為潛在的腎癌早期診斷、分子靶向治療及預后評估的一項分子標志物。但PIK3CD-AS1在腎癌中的具體作用機制及參與的具體信號通路，尚需進一步探討。