玉米須酸性多糖的結構表征及降血脂活性

楊夏， 孫從永， 余江南， 徐希明

(江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮江 212013)

多糖作為一種天然活性生物大分子，來源廣泛、安全性高且具有良好的調脂和降脂活性，如目前研究最多的褐藻藻酸雙酯鈉、杏鮑菇多糖和硫酸軟骨素等[1-3]。玉米須多糖是一種富含糖醛酸的雜聚糖，基本無毒副作用，具有顯著的降血糖和調脂活性[4-5]。玉米須多糖中存在大量的玉米須酸性多糖(acid corn silk polysaccharide，ACSP)純化組分，然而關于ACSP的相關結構特征及其對血脂活性的影響尚不清楚。因此，本實驗擬以簡便可行的大孔陰離子交換樹脂和凝膠柱純化法從玉米須多糖中分離純化ACSP組分，考察其基本結構特征，并利用高脂飼料致高血脂小鼠模型考察ACSP對體內血脂的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

干燥玉米須購于鎮江同仁堂藥店；D315大孔樹脂(天津市津達正通環保科技有限公司)；葡聚糖凝膠柱Sephadex G100(北京瑞達恒輝科技發展有限公司)；葡聚糖標準品、葡萄糖醛酸標準品和單糖標準品(上海Sigma公司)；剛果紅(國藥集團)；光譜級溴化鉀(國藥集團)；雄性ICR小鼠(清潔級)，體質量(20±2)g，購自江蘇大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(Su) 2013- 0011，于室溫(23±2)℃下飼養；血漿膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

ALC-110.4型電子天平(德國Sartorius公司)；UV-2600(日本島津公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；冷凍干燥機(德國Christ)；紅外光譜儀(Thermal Fisher Scientific公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；RE-2000A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 ACSP的分離純化

玉米須粗多糖的提取按照文獻[6-7]，采用水提醇沉，三氯乙酸法除蛋白。粗多糖20 g經D315大孔陰離子交換樹脂分離，控制層析柱流速為1 mL·min-1，依次用一定體積的純化水及0.1、0.3、0.5 mol·L-1NaCl溶液洗脫，每10 mL收集1管。苯酚硫酸法[8]檢測洗脫液中的多糖含量，以對應光密度D值作為縱坐標，以管數為橫坐標，繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線，合并相同組分洗脫液，濃縮、透析(3.5 kD)后凍干，得到不同玉米須多糖組分。收集由0.3 mol·L-1NaCl溶液洗脫得到的多糖組分5.642 3 g，進一步經葡聚糖凝膠Sephadex G100層析柱純化，控制層析柱流速為1 mL·min-1，以純化水洗脫，5 mL收集1管，同上操作，繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線，合并單一洗脫峰的洗脫液，濃縮、透析(14 kD)后凍干，即得ACSP。

1.3 ACSP結構研究

1.3.1 糖含量測定 中性糖的含量用苯酚硫酸法測定，酸性糖含量用硫酸咔唑法[9]測定。

1.3.2 高效凝膠色譜法測分子量 分析儀器及參數：Agilent 1260-ELSD 檢測器(蒸發溫度30 ℃，漂移管溫度30 ℃，氮氣流速1.59 L·min-1)；流動相：20 mmol·L-1乙酸銨水溶液(0.6 mL·min-1)；色譜柱：TSK-凝膠柱G4000PW(7.5 mm×300 mm)，TSK-保護柱PWH(7.5 mm×75 mm)。

標準曲線的建立：分別精密稱取不同分子量的葡聚糖標準品(670，270，80，25，5 kD)10 mg配制成1 mg·mL-1的標準品溶液，經0.45 μm濾膜過濾后，20 μL進樣。以不同標準品出峰時間(t)為橫坐標，相應葡聚糖標準品的分子量的自然對數(lnMw)為縱坐標，繪制標準曲線。

玉米須多糖樣品分子量測定：精密稱取ACSP，配制成1 mg·mL-1的水溶液，經0.45 μm濾膜過濾后，進樣分析，記錄出峰時間，代入標準曲線，計算多糖的分子量。

1.3.3 紅外光譜測定 傅里葉變換紅外光譜儀參數：溫度為30 ℃，掃描次數32，分辨率16 cm-1；取適量干燥的ACSP，與干燥的溴化鉀粉末研磨混合，壓片，上機測定。記錄4 000 cm-1～ 400 cm-1范圍內的紅外光譜圖。

1.3.4 柱前PMP衍生化法測定單糖組成[10-11]儀器及參數：Agilent 1260-DAD 檢測器(λ=254 nm)；流動相：A(0.1% 甲酸-50 mmol·L-1乙酸銨溶液)，B(0.1% 甲酸水溶液)，C(乙腈)，1 mL·min-1；梯度方法：0～6 min，A(80%)，C(20%)；6～6.5 min，B(80%)，C(20%)，6.5～20min，B(80%)，C(20%)；色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；標準單糖樣品：1 mg·mL-1的D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-巖藻糖8種標準單糖對照品溶液和作為內標的乳糖標準液；各單糖濃度均為1 mg·mL-1的混合標準液并加入終濃度為5 mg·mL-1的乳糖內標；30 mg ACSP樣品水解后加入乳糖內標；各樣品按文獻方法衍生化后取20 μL進樣分析，記錄色譜圖，根據各單糖峰面積計算單糖之間的比例。

1.3.5 剛果紅試驗測定多糖鏈構象[12]稱取5 mg ACSP溶于2 mL去離子水，加入等體積剛果紅試劑(910 μmol·L-1)，充分混勻，以純化水作為空白，在紫外分光光度計進行300～ 700 nm波長范圍內掃描，記錄最大吸收波長。在各樣品溶液中逐步加入NaOH水溶液(1 mol·L-1)，使溶液中NaOH濃度依次為0.05，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4 mol·L-1，記錄不同NaOH濃度下溶液的最大吸收波長。以NaOH濃度(C)為橫坐標，最大吸收波長(λmax)為縱坐標，繪制折線圖。

1.4 ACSP降血脂活性研究

1.4.1 動物分組 小鼠適應性喂養3 d后，隨機均分為6組(n=7)，即空白對照組、模型組、500 mg·kg-1ACSP高劑量組(ACSP-500)、100 mg·kg-1ACSP低劑量組(ASCP-100)、陽性藥洛伐他汀組和陽性藥脂必妥組。

1.4.2 高脂飼料誘導高血脂小鼠模型的建立[13]空白對照組飼喂標準維持型飼料，其余各組均飼喂高脂飼料[配方組成(%)：黃豆15，麩皮12，小麥粉11，玉米粉15，魚粉2、骨粉2、鹽0.7，復合多維0.3、豬油15，油花生8，麻油3，雞蛋2，奶粉2，蔗糖12]；ACSP組每日分別以相應劑量的ACSP灌胃，陽性組分別灌胃與ACSP低劑量組相同且等體積的洛伐他汀(100 mg·kg-1)和中成藥脂必妥(100 mg·kg-1)。

1.4.3 血樣采集與測定 給藥30 d后，各組小鼠禁食24 h不禁水，眼球取血置于肝素管中。3 500 r·min-1離心10 min，取上層血漿，-20 ℃保存待用；按總膽固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C試劑盒標準操作流程檢測各樣品的4項指標，并根據下式計算反映心血管疾病風險的指標：Kch=(TG/5+LDL-C)/HDL-C；

1.5 數據處理

2 結果

2.1 ACSP的分離純化

20玉米須粗多糖經分離純化，得到組分ACSP 4.335 4 g，收率約為21.68%。

如圖1所示，由D315洗脫曲線可知，0.3 mol·L-1NaCl溶液洗脫組分ACSP含量最高；由凝膠柱洗脫曲線可知ACSP峰形較窄且對稱，表明其分子量分布范圍窄，純度較高。

圖1 ACSP的洗脫曲線

2.2 ACSP的結構

2.2.1 糖含量 測得ACSP中中性糖和糖醛酸含量分別為(55.83±2.98)%和(37.00±1.03)%，酸性糖含量高，且中性糖和酸性糖總含量超過90%，表明ACSP純度較高。

2.2.2 分子量 高效凝膠色譜圖如圖2所示，標準葡聚糖分子量的自然對數與其保留時間符合以下關系式：lnMw=-0.803 5t+25.441，R2=0.994 6；將ACSP保留時間代入標準曲線，得到ACSP的分子量為19.32 kD。

圖2 ACSP分子量高效凝膠色譜圖

2.2.3 紅外光譜 如圖3所示，ACSP表現多糖特征性的共振吸收峰。3 434 cm-1處較寬吸收峰是多糖典型的紅外光譜吸收峰，來源于多糖結構中大量存在的O-H鍵伸縮振動吸收；其次，2 927 cm-1處歸屬于C-H鍵伸縮振動吸收峰，1 400～1 600 cm-1附近的吸收峰歸屬于C=O的非對稱伸縮振動峰；1 637 cm-1和1 508 cm-1是由羧基結構中的C=O 和C-O伸縮振動產生的吸收峰。

圖3 ACSP紅外測定圖譜

2.3.4 單糖組成 由圖4可知，各單糖之間分離程度較好。 ACSP由7種單糖組成，分別為D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸，摩爾比為1.00 ∶0.20 ∶0.91 ∶1.85 ∶0.60 ∶0.24 ∶2.00，其中葡萄糖醛酸含量最高，此結果與ACSP的糖含量測定結果及紅外圖譜分析結果一致。

2.3.5 ACSP鏈構象 由圖5可知，與剛果紅對照液相比，ACSP+剛果紅混合液的最大吸收波長未出現紅移現象。

1：D-甘露糖；2：L-鼠李糖；3：D-葡萄糖醛酸；4：乳糖(內標)；5：D-葡萄糖；6：D-半乳糖；7：L-阿拉伯糖；8：D-木糖；9：L-巖藻糖

圖4ACSP單糖組成測定圖譜

圖5 ACSP剛果紅測定結果

2.3 ACSP的降血脂活性

如表1所示，與對照組相比，模型組血漿總膽固醇(t=4.42)、三酰甘油(t=4.02)和LDL-C(t=3.48)水平均顯著增高(P<0.05)，而HDL-C水平明顯降低(t=3.15，P<0.05)，表明高血脂模型建立成功。與模型組相比，100 mg·kg-1ACSP組血漿總膽固醇(t=2.20)、三酰甘油(t=2.93)和Kch值(t=2.31)均明顯降低(P<0.05)，LDL-C和HDL-C水平無變化。Kch值越小代表發生心血管疾病的風險越小，說明在此模型中，低劑量ACSP顯示一定的降血脂活性；當ACSP劑量為500 mg·kg-1時，血漿總膽固醇(t=4.18)、三酰甘油(t=3.53)、LDL-C(t=3.54)和Kch(t=3.24)較模型組顯著降低(P<0.05)，且降低至對照組小鼠水平；此外，ACSP給藥組對模型小鼠的HDL-C水平無明顯改善作用；脂必妥陽性組結果與ACSP組基本相同。

組別總膽固醇(mmol·L-1)三酰甘油(mmol·L-1)LDL-C(mmol·L-1)HDL-C(mmol·L-1)Kch對照組3.15±0.451.23±0.170.77±0.135.49±0.470.23±0.04模型組4.69±0.56a1.87±0.39a1.47±0.62a4.54±0.45a0.34±0.08aACSP-100組3.85±0.68b1.40±0.12b1.77±0.334.90±0.600.26±0.04bACSP-500組3.18±0.62b1.28±0.29b0.76±0.15b4.69±0.510.22±0.06b洛伐他丁組3.30±0.49b1.41±0.29b0.74±0.15b5.28±0.86b0.21±0.03b脂必妥組3.58±0.78b1.28±0.22b0.74±0.18b5.03±0.300.20±0.05bF值5.594.6211.862.853.71P值0.0010.0030.0000.0280.011

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較

3 討論

臨床上常用的他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑和膽汁酸螯合劑類等降血脂藥物，分別從減少內源性脂質合成、加快體內脂質代謝和抑制外源性脂質吸收三個方面調節血脂水平；但是均存在一定的不良反應，如樹脂類膽汁酸螯合劑不溶于水，可能導致惡心腹脹；貝特類和他汀類藥物可能導致高尿酸血癥、神經損傷、肌肉損傷和皮膚病等[14]。玉米須安全性很高，Wistar大鼠飼喂玉米須90 d未見任何毒性反應[15]。玉米須粗多糖經超濾離心后得到的多糖組分PCS2，對高脂飲食和鏈佐星造模的高血糖模型小鼠具有一定的降血脂活性[4]。但是，其未依據玉米須多糖組分的性質不同進行分離純化，對于其純化組分的結構研究仍有欠缺。

本實驗利用大孔陰離子交換樹脂和葡聚糖凝膠柱分離純化玉米須多糖，得到含量最高的酸性多糖純化組分ACSP。ACSP在大孔陰離子交換樹脂上會有保留，因此可用一定濃度的NaCl溶液洗脫純化。此方法重復性高、耗費低且同一純化組分性質一致。結構研究表明，ACSP是由7種單糖組成的雜聚糖，其糖醛酸含量為(37.00±1.03)%，分子量為19.32 kD，紅外光譜中1 400～1 600 cm-1處的吸收峰提示在ACSP中存在大量的糖醛酸[16]，840 cm-1處的吸收峰提示ACSP的糖苷鍵為α-構型，此結果與文獻[17-18]等結果一致。剛果紅試驗中，ACSP與剛果紅的絡合物未發生明顯紅移現象，此結果與其他非三螺旋結構的多糖相同[19-20]，證明ACSP不是三螺旋結構，此結果也驗證了關于雜多糖不能形成三螺旋結構的假說[21]。

糖醛酸是一種具有特殊結構的單糖，即結構中的伯羥基可氧化成為羧基，從而使多糖表現出特殊的性質。糖醛酸含量對多糖脂質結合能力有影響，Pau-Roblot等[22]研究發現主要由糖醛酸組成的同聚半乳糖醛酸果膠類物質可以吸附脂質分子，如膽固醇和亞麻酸等，其中，糖醛酸的含量、種類、構型均可影響其與脂質分子的結合。本實驗結果顯示，與模型組相比，高劑量ACSP組血漿總膽固醇、三酰甘油、LDL-C和Kch值均顯著降低，表明ACSP對高脂飼料誘導的高血脂模型小鼠表現出明顯的降血脂活性。然而ACSP中糖醛酸含量與其降血脂活性大小之間的關系仍需進一步考察。由于目前儀器分析水平的限制，大量活性顯著的多糖未能得到深入研究，多糖重復單元的確認、理化性質的考察、體內藥物動力學的研究仍亟待解決。