GFP報告因子結(jié)合流式細胞術(shù)的蛋白-蛋白相互作用單細菌水平分析

蘇柳欽,張健強,何盛斌,吳麗娜,顏曉梅

(廈門大學 化學化工學院,譜學分析與儀器教育部重點實驗室,化學生物學福建省重點實驗室,福建廈門361005)

蛋白-蛋白相互作用是細胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分,參與了各種代謝途徑和生理過程[1-2]．對蛋白-蛋白相互作用進行分析有助于解析疾病的發(fā)生機制,對藥物的設(shè)計篩選具有重要的指導(dǎo)意義[3]．基于腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)功能重構(gòu)的細菌雙雜交(bacterial adenylate cyclase two-hybrid,BACTH)系統(tǒng)是蛋白-蛋白相互作用經(jīng)典技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)的衍生,具有實驗周期短、轉(zhuǎn)化率高、蛋白無需核定位等優(yōu)點[4]．BACTH系統(tǒng)利用了百日咳博代桿菌(Bordetellapertussis)中的AC催化域是由兩個互補片段T25和T18組成的特點,當T25和T18分別與可發(fā)生相互作用的多肽或者蛋白質(zhì)融合表達時,嵌合蛋白的二聚化可以導(dǎo)致AC片段功能性的互補以及環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的生成，cAMP與分解代謝激活蛋白(catabolite activator protein,CAP)結(jié)合,從而調(diào)控報告基因的表達[5]．目前,BACTH系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于特定蛋白對的相互作用鑒定以及蛋白質(zhì)相互作用文庫的篩選[6-7]．在生命醫(yī)學研究方面,BACTH系統(tǒng)也發(fā)揮了重要的作用．Zoued等[8]通過對細菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)的收縮鞘中各組件的相互作用分析,揭示了其聚合的操縱機制以及內(nèi)管裝配的協(xié)調(diào)機制．Tao等[9]利用BACTH系統(tǒng)對肉毒毒素B進行飽和誘變篩選,增強了工程型肉毒毒素B特異性地靶向人類突觸結(jié)合蛋白Ⅱ,提高了肉毒毒素B對神經(jīng)性疾病的治療效果．

BACTH系統(tǒng)主要以lacZ為報告基因,對于報告基因所表達的β-半乳糖苷酶,傳統(tǒng)的檢測方法主要是通過測定鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷或4-甲基傘形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷這類特異性底物水解產(chǎn)生的分子吸光度或熒光的變化對酶活性進行檢測[4,10]．然而，這類方法得到的是大量細菌中β-半乳糖苷酶表達量及活性的平均結(jié)果,掩蓋了細菌個體間β-半乳糖苷酶表達量的差異．在單細菌水平考察β-半乳糖苷酶的表達有利于更好地解析基因表達的隨機性、基因調(diào)控以及微生物的生理過程,對深入理解BACTH系統(tǒng)的工作機理從而針對性地改進實驗方法也有極大幫助．此外,單細菌水平的蛋白-蛋白相互作用研究有助于更準確地考察蛋白在細菌介導(dǎo)的活細胞中相互作用的狀況,對于揭示蛋白-蛋白相互作用相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制具有明顯優(yōu)勢[11]．流式細胞術(shù)是一種功能強大的單細胞分析手段,具有檢測速度快、精度高和多參數(shù)分析等特點,已在蛋白質(zhì)組學和系統(tǒng)生物學中發(fā)揮重要的作用[12]．然而,由于細菌個體微小,傳統(tǒng)的流式細胞儀難以在單細菌水平對其內(nèi)部的蛋白質(zhì)進行定量分析并考察蛋白-蛋白相互作用．結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù),本課題組自行研制的超高靈敏流式檢測裝置(HSFCM)散射光通道可實現(xiàn)粒徑為24 nm的二氧化硅納米顆粒和粒徑為7 nm的金納米顆粒的檢測,熒光通道的檢測靈敏度為3個Alexa Fluor 532分子[13],較傳統(tǒng)流式細胞儀的散射和熒光檢測靈敏度分別提升4～5個數(shù)量級和1～2個數(shù)量級,已被開發(fā)應(yīng)用于細菌生化體系的分析[14-18]．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli) ER2738，在質(zhì)粒構(gòu)建中使用；大腸桿菌BTH101(基因型:F-,cya-99,araD139,galE15,galK16,rpsL1,hsdR2,mcrA1,mcrB1),由法國地中海微生物研究中心Emmanuelle Bouveret博士惠贈,為BACTH系統(tǒng)的報告菌株．

質(zhì)粒：pEB354(pKT25-linker)、pEB355(pUT18C-linker)、pEB356(pUT18C-pal)由Emmanuelle Bouveret博士惠贈；pTW2(含lac啟動子調(diào)控的gfp基因)由中國科學院微生物研究所楊克遷博士惠贈；質(zhì)粒pKT25-His-tolB、pKT25-lac-T18、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal為本課題組構(gòu)建．

1.1.2 試 劑

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0購自寶生物工程(大連)有限公司，TransStart FastPfu DNA Polyme-rase(AP221-01)、5×TransStart FastPfu Buffer、dNTP mixture購自北京全式金公司，Seamless Assembly and Cloning Kit購自北京艾德萊生物科技有限公司，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-gal)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程有限公司，本研究所涉及的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示．

表1 本研究所用引物

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(Airtech公司)，DYCP-31F瓊脂糖水平電泳儀(北京六一儀器廠)，SKY 200B小型全溫恒溫培養(yǎng)搖床(上海蘇坤實業(yè)有限公司)，DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，Allegra X-15R Centrifuge低溫冷凍離心機(Beckman公司)，T100TMThermal Cycler基因擴增儀(BIO-RAD 公司)，IX73 型倒置熒光顯微鏡(Olympus 公司)，本課題組自行研制的HSFCM．

1.2 方 法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建

最早知道愛克發(fā)還是在兒時，記憶中Agfa膠卷是攝影發(fā)燒友的最愛，而這段回憶也拉近了我們與這位影像巨頭的距離。從初創(chuàng)歲月到今天的數(shù)碼時代，愛克發(fā)對影像的關(guān)注從未停步，150多年的深耕細作不僅構(gòu)成了其現(xiàn)有的三大產(chǎn)業(yè)版圖：由印版、CTP、噴墨設(shè)備、軟件等產(chǎn)品組成的印藝板塊，以及醫(yī)療板塊、特殊材料板塊，其中，印藝板塊占據(jù)其產(chǎn)業(yè)版圖的半壁江山，更使其以細分領(lǐng)域領(lǐng)導(dǎo)者的身份與實力，引導(dǎo)影像領(lǐng)域的技術(shù)變革和產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新。

質(zhì)粒pKT25-lac-T18的構(gòu)建:以質(zhì)粒pEB355為模板,用表1中引物lac-T18-F/lac-T18-R擴增基因片段lac-T18,同時,用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對質(zhì)粒pEB354進行單酶切,擴增出的基因片段和酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析后,用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0試劑盒進行純化,最后兩個片段采用Gibson組裝連接[21]．

(a)流體動力學聚焦樣品流與激光光斑正交于流動室的示意圖;(b)光路圖．圖1 實驗室自行研制的雙通道HSFCM示意圖Fig.1 Schematic diagram of the laboratory-built dual-channel high sensitivity flow cytometer (HSFCM)

質(zhì)粒pKT25-His-tolB-lac-T18-pal的構(gòu)建:以質(zhì)粒pEB356為模板,用表1中引物lac-T18-pal-F/lac-T18-pal-R擴增基因片段lac-T18-pal,同時,用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ對質(zhì)粒pKT25-His-tolB進行單酶切,擴增出的基因片段和酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析后,用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purifi-cation Kit Ver.4.0試劑盒進行純化,最后兩個片段采用Gibson組裝連接[21]．

1.2.2 細菌樣品的制備

提取質(zhì)粒pKT25-lac-T18、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal,以BTH101作為報告菌株,按pKT25-lac-T18/pTW2、pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2的組合進行共轉(zhuǎn)化．共轉(zhuǎn)化時兩種質(zhì)粒依次加入,細菌復(fù)蘇后涂布于含氨芐青霉素和卡那霉素的LB/IPTG/X-gal固體培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)48 h．隨后從平板上隨機挑取單菌落,接種于LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)22 h．移取50 μL菌液離心,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后棄上清,于4 ℃下保存,待測．

1.2.3 單細菌水平gfp報告基因的表達分析

HSFCM檢測:將待測樣品用PBS調(diào)節(jié)細菌濃度至109mL-1后上機檢測,同時收集散射光信號和綠色熒光信號(BP520/35)．所用的HSFCM分為4個部分,分別為激光光源和光束形成系統(tǒng)、流動室和液流驅(qū)動系統(tǒng)、光路系統(tǒng)(包括各種濾光片)以及信號檢測、存儲、顯示和分析系統(tǒng)[22-24]．如圖1所示,它的工作原理為:分散在溶液中的細菌與溶液一起由氮氣驅(qū)動進入毛細管,從毛細管流出后,溶液在鞘液作用下被聚焦形成直徑很小的液流,保證樣品以單個細菌通過激光探測區(qū)；激光器發(fā)出的488 nm激光經(jīng)反射鏡(M)反射后,被消色差膠合透鏡(L)聚焦為直徑約10 μm的激光光斑,激光光斑與被鞘液流聚焦后的樣品流正交于石英流動室(C)的中心處；樣品由激光照射后發(fā)出的光信號經(jīng)非球面透鏡(AL)收集,被二向色濾光片(DicF-500)分成兩束,波長小于500 nm的光信號(散射光)被90°反射入第1個光電倍增管(PMT-1)中檢測,大于500 nm的光信號經(jīng)過邊緣濾光片(EF488)后,經(jīng)過帶通濾光片(BP520/35)濾除雜散光進入第2個光電倍增管(PMT-2)檢測．

熒光顯微鏡成像:將待測樣品用PBS調(diào)節(jié)細菌濃度至1010mL-1,吸取10 μL樣品于載玻片上,洗耳球吹干后,滴加適量抗熒光猝滅劑,小心蓋上蓋玻片,并用指甲油將蓋玻片固定；然后,在100×放大的油鏡上滴加少量Nikon專用鏡油,放上制備好的玻片觀察．

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)相互作用的HSFCM檢測原理

圖2 基于GFP報告因子研究蛋白-蛋白相互作用的HSFCM檢測原理Fig.2 Schematic of HSFCM detection based on GFP reporter protein for protein-protein interaction study

如圖2所示,在BACTH-GFP系統(tǒng)中,質(zhì)粒pKT25-X-lac-T18-Y能同時獨立表達融合蛋白T25-X和T18-Y．質(zhì)粒pTW2中含有一段從BTH101基因組中截取的lac啟動子序列,用以啟動下游gfp基因的表達[25]．將以上兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到報告菌株BTH101中,X和Y蛋白表達并相互作用會誘發(fā)T25和T18功能性互補，繼而催化ATP生成cAMP,cAMP與CAP結(jié)合,激活gfp報告基因的表達,所發(fā)出的綠色熒光可以通過HSFCM檢測．HSFCM每分鐘可以對高至1萬個顆粒的信號進行檢測,應(yīng)用HSFCM對單個細菌的散射光和熒光信號的同時檢測可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)相互作用的單細菌水平的快速高通量分析．

2.2 單細菌水平蛋白質(zhì)相互作用檢測方法的建立

Tol-Pal系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌高度保守的膜蛋白系統(tǒng)之一,主要由轉(zhuǎn)運蛋白TolB、TolA、TolR、TolQ和脂蛋白Pal之間相互作用組成．其中TolB蛋白和Pal蛋白組成了細菌外膜復(fù)合體,它們之間的相互作用對于維持革蘭氏陰性菌細胞膜的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要[26]．本研究以Pal和TolB為模型,將它們克隆到雙雜交質(zhì)粒載體上,使它們分別與T18和T25片段融合表達,并以不含相互作用蛋白的質(zhì)粒pKT25-lac-T18為陰性對照．如圖3所示,細菌BTH101 pKT25-lac-T18/pTW2經(jīng)過22 h培養(yǎng)后在綠色熒光檢測通道只有微弱的背景熒光信號(圖3(b)),表明不含相互作用蛋白的細菌無法激活gfp報告基因表達．而BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2在綠色熒光通道有強的熒光信號(圖3(d)),但是其熒光信號與散射光信號并非一一對應(yīng),部分細菌只有散射光信號．根據(jù)兩者的散射光信號與熒光信號峰面積的二維散點圖(圖3(e))以及熒光信號峰面積統(tǒng)計分布直方圖(圖3(f)),可以發(fā)現(xiàn)實驗組樣品在熒光通道分成了兩群:66.1%的細菌的熒光信號強度明顯高于陰性對照組,可見蛋白相互作用激活了gfp報告基因表達;另外33.9%的細菌的熒光信號分布與陰性對照組樣品重疊,表明這部分細菌的gfp報告基因未被激活．造成這一現(xiàn)象的可能原因是:在BACTH系統(tǒng)中相互作用蛋白和報告基因的表達都受乳糖操縱子的調(diào)控,蛋白發(fā)生相互作用后生成cAMP,cAMP激活報告基因表達,生成的cAMP同樣也能激活相互作用蛋白的表達[4]．因此,相互作用蛋白的表達、cAMP的生成、報告基因的表達形成了復(fù)雜的正反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，造成了BACTH系統(tǒng)報告基因的異質(zhì)性表達,部分細菌被完全激活而高表達蛋白,另外部分細菌未被激活而只有本底表達[19]．這種蛋白表達的差異容易被集權(quán)平均的檢測方法所掩蓋,因此,需要從單細菌水平分析才能揭示BACTH系統(tǒng)中蛋白表達存在的這種雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象,更準確地分析蛋白質(zhì)之間的相互作用．

采用熒光顯微鏡進一步對gfp報告的蛋白相互作用進行表征．如圖3(g)～(j)所示,在熒光場視野下只有BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2可以觀察到菌體發(fā)出明亮的熒光，對比明場下的細菌,可發(fā)現(xiàn)仍有部分細菌沒有熒光,顯微鏡觀察到的現(xiàn)象與HSFCM的檢測結(jié)果一致．

2.3 培養(yǎng)時間對gfp報告基因表達的影響

為考察不同培養(yǎng)時間下BACTH-GFP系統(tǒng)報告因子表達量的變化，隨機挑取共轉(zhuǎn)化后在相應(yīng)抗性篩選平板上形成的單菌落，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后,每隔2 h取樣分析．如圖4所示,隨著培養(yǎng)時間的增加,表達GFP報告因子的細菌比例逐漸增加(從16 h的20.3%升高至24 h的58.4%),這部分細菌的熒光信號中位值也隨之增加(從16 h的17 224.5增加到24 h的29 740.6),說明單個細菌GFP報告因子表達量隨培養(yǎng)時間的增加不斷提高．當培養(yǎng)時間達到22 h之后,表達GFP報告因子的細菌比例以及單個細菌GFP報告因子表達量逐漸趨于穩(wěn)定,因此選擇培養(yǎng)22 h的細菌進行HSFCM 檢測．

2.4 IPTG對gfp報告基因表達的影響

在BACTH系統(tǒng)中報告基因的表達受乳糖操縱子的調(diào)控,而乳糖操縱子存在正負調(diào)控機制．cAMP-CAP是一個重要的正調(diào)控物質(zhì),它與操縱子上的啟動區(qū)結(jié)合,激活下游基因轉(zhuǎn)錄．另外,乳糖操縱子也受lacI基因編碼的阻遏蛋白的負調(diào)控,阻遏蛋白通過與操縱子結(jié)合,阻止RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄下游基因．當向體系中加入誘導(dǎo)劑時,誘導(dǎo)劑會優(yōu)先與阻遏蛋白結(jié)合,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,不再與操縱子上的DNA序列相結(jié)合,從而使RNA聚合酶能夠起始轉(zhuǎn)錄下游基因[27]．IPTG是一種作用極強的乳糖操縱子誘導(dǎo)劑,不被細菌代謝且性質(zhì)穩(wěn)定,被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的表達．因此,考察了不同濃度IPTG誘導(dǎo)下的gfp報告基因的表達情況．分別用0,50,200,500 μmol/L的IPTG對BTH101 pKT25-His-tolB-lac-T18-pal/pTW2進行誘導(dǎo)培養(yǎng),測定培養(yǎng)16,18,20,22,24 h后細菌表達GFP報告因子的情況．如圖5所示,隨著培養(yǎng)時間的增加,表達GFP報告因子的陽性菌的熒光信號強度不斷增加,然而在同一培養(yǎng)時間下,不同濃度IPTG對gfp報告基因的表達幾乎沒有影響．這可能是由于BTH101基因組中l(wèi)acI基因表達的阻遏蛋白量較少,引入的多拷貝質(zhì)粒中的lac啟動子削弱了阻遏蛋白的負調(diào)控作用,導(dǎo)致IPTG無法發(fā)揮誘導(dǎo)作用[28]．

圖5 在不同培養(yǎng)時間及不同濃度IPTG作用下表達GFP報告因子陽性菌的熒光信號強度中位值Fig.5 The median fluorescence intensities of positive cells with expression of GFP reporter protein induced with various concentrations of IPTG for different cultivation time

2.5 不同單菌落gfp報告基因表達的異質(zhì)性分析

隨機挑取了10個共轉(zhuǎn)化后在相應(yīng)抗性篩選平板上形成的單菌落,擴大培養(yǎng)22 h后采用HSFCM對細菌gfp報告基因表達情況進行分析．如圖6所示,不同單菌落培養(yǎng)得到的菌液中表達GFP報告因子的陽性菌之間表現(xiàn)出較大的熒光信號強度差異(圖6(a)),且表達GFP報告因子的細菌比例也呈現(xiàn)明顯的差異(圖6(b)),它們的平均值分別為16 022.9±3 742.8和(37.5±21.9)%,各自的變異系數(shù)為23.4%和58.1%．

這種異質(zhì)性現(xiàn)象是由于細菌內(nèi)質(zhì)粒拷貝數(shù)不同導(dǎo)致蛋白表達量存在較大的差異,這些差異隨著細菌的增殖被逐漸放大,最終導(dǎo)致單菌落之間蛋白表達的異質(zhì)性[4]．此外,在BACTH系統(tǒng)中,雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象也會造成單菌落之間蛋白表達的巨大差異．傳統(tǒng)表征方法獲得的是眾多細菌蛋白表達集權(quán)平均的結(jié)果,掩蓋了個體蛋白表達的異質(zhì)性,基于GFP報告因子結(jié)合超高靈敏流式檢測技術(shù)建立的研究方法從單細菌水平分析,真實地反映了報告基因的表達水平以及表達GFP報告因子的細菌所占比例,為蛋白質(zhì)相互作用研究提供了更加直觀準確的分析方法．

3 結(jié) 論

本研究中引入lac啟動子控制的gfp作為蛋白質(zhì)相互作用的報告基因,采用實驗室自行研制的HSFCM建立了一種單細菌水平、高通量、快速的蛋白-蛋白相互作用分析方法．實驗結(jié)果表明:蛋白-蛋白相互作用激活了gfp報告基因的表達,并存在雙穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象．單細菌水平的HSFCM分析真實地反映了蛋白質(zhì)相互作用報告基因的表達水平以及表達GFP報告因子的細菌所占的比例,相對于傳統(tǒng)集權(quán)平均的表征方法更準確、簡單．基于該方法,本研究發(fā)現(xiàn)不同單菌落GFP報告因子表達量和表達蛋白的細菌比例都存在較大的異質(zhì)性．以上結(jié)果表明建立的單細菌水平BACTH-GFP分析方法能夠揭示蛋白質(zhì)相互作用報告基因表達的個體差異,有效地區(qū)分表達GFP報告因子的陽性菌和報告基因未被激活表達的陰性菌,為相互作用蛋白對的檢測及篩選提供了有效的分析手段,將有助于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的解析．

(a) 表達GFP報告因子的陽性菌熒光信號強度中位值;(b) 表達GFP報告因子的細菌比例．圖6 不同單菌落gfp報告基因表達的異質(zhì)性分析Fig.6 Heterogeneity analysis of the expression of gfp reporter gene among different colonies