5-羥甲基糠醛與氨基酸反應形成的風味物質

王 歌 曾 睿 邱瑞霞 黃才歡 鄭 潔

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510000)

5-羥甲基糠醛又稱羥甲基糠醛(HMF)，是一種呋喃類化合物。純品是暗黃色液體或粉末，具有吸濕性，易液化。HMF具有活潑的α,β-不飽和羰基結構，化學性質非常活潑，可發生氧化還原、脂化、聚合、水解等多種反應。HMF普遍存在于熱加工食品中，它以己糖為前體物質，主要通過美拉德反應和焦糖化反應產生[1]。此外還可通過2條途徑產生HMF：① 葡萄糖、蔗糖、果糖等在高溫下直接裂解產生，其中果糖呋喃陽離子是HMF重要的前體物質；② 二羰基化合物如丙酮醛和甘油醛等發生羥醛縮合產生HMF[2]。由于HMF在動物和人體內可能轉化為致癌物質羥甲基糠酸磺酸鹽，所以HMF被認為是一種食品內源污染物。HMF含有羰基，可與氨基發生美拉德反應，Gokmen等[3]、Zhao等[4]都研究證明HMF與氨基酸可發生美拉德反應。美拉德反應是食品風味的主要貢獻者，HMF是美拉德反應中的中間產物，所以推測HMF與氨基酸可能會產生風味物質，但目前有關食品中HMF的研究主要集中在HMF的危害及控制等方面[5]，缺少HMF對風味物質影響的研究。

本研究擬將氨基酸與HMF反應，利用頂空固相微萃取法提取并用GC-MS鑒定反應體系中的揮發性成分，以此研究HMF對食品風味的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-絲氨酸(Ser)、L-蘇氨酸(Thr)、L-丙氨酸(Ala)、γ-氨基丁酸(Gaba)、5-羥甲基糠醛(HMF)：分析純，百靈威科技有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

氣質聯用儀：7890/5975型，美國安捷倫公司；

毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：DB-1MS型，美國安捷倫公司；

SPME萃取頭：75 μm CAR/PDMS型，美國Supelco公司；

旋轉蒸發儀：EYELA型，上海愛朗儀器有限公司；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 HMF與氨基酸反應體系的建立 根據楊忠全等[6-8]的方法，修改如下：將L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、γ-氨基丁酸和HMF分別用pH 7的磷酸緩沖液(PBS)溶解，配成含氨基酸250 mmol/L，HMF 2.5 mmol/L的混合液4 mL，置于20 mL的不銹鋼管中。旋緊不銹鋼管蓋(帶有聚四氟乙烯墊片)，放置于帶有磁力攪拌裝置的油浴鍋中(攪拌速度為300 r/min)， 在160 ℃下反應15 min，反應結束后將試管迅速放入冰水浴中冷卻。

1.3.2 反應物濃度與反應時間對特征風味物質產生的影響

設置2個不同濃度HMF和氨基酸的反應體系，分別是：HMF 2.5 mmol/L+氨基酸250 mmol/L；HMF 5.0 mmol/L+氨基酸500 mmol/L。在160 ℃下分別反應8，15 min，研究反應物濃度和反應時間對風味物質形成的影響。

1.3.3 反應體系的pH值和褐變的測定 用pH計測定反應前后體系的pH變化；用紫外分光光度計，在420 nm下測定反應體系的吸光度(OD值)以判斷褐變程度。

1.3.4 揮發性物質的提取與測定 將反應物用PBS定容到5 mL，加入1 g氯化鈉，置于15 mL的頂空固相微萃取玻璃瓶中[9-10]，用帶有尼龍材質墊片的瓶蓋將玻璃瓶迅速密封。將玻璃瓶置于帶有磁力攪拌的恒溫水浴鍋中，80 ℃下平衡60 min，然后迅速將頂空固相微萃取CAR/PDMS 萃取頭插入密封的小瓶中，并將萃取頭的纖維懸在樣品的頂空并保持 30 min[11-12]。萃取后將萃取頭立即插入氣質聯用儀的進樣口，在250 ℃下維持15 min，釋放被吸附的揮發性物質。GC-MS分析條件：電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描時間3.89 s，氦氣流速0.8 mL/min，質譜掃描范圍30～400。柱溫箱的升溫步驟為：初始溫度45 ℃，保持5 min，以6 ℃/min 升溫到 90 ℃，以 10 ℃/min 升溫到 220 ℃，維持10 min。通過NIST08.L 譜庫檢索比對結果，對物質進行定性，選擇匹配度80%以上的物質分析，利用峰面積比較物質的相對含量。

1.3.5 數據處理與分析 利用SPSS 13.0軟件處理GC峰面積數據，用平均值和標準偏差表示結果。使用 Duncan 檢驗分析顯著性，顯著性水平為P=0.05，每個試驗平行測定3次。

2 結果與分析

2.1 反應前后體系的pH與褐變程度的變化

由表1可知，在4個HMF-氨基酸反應體系中，反應后pH都略有降低，但沒有顯著性差異(P>0.05)。與文獻[13]的結論一致。4種氨基酸與HMF發生反應前均沒有吸光度值，發生反應后都產生了不同程度的褐變(OD420值)，與反應前相比具有顯著性差異(P<0.05)，說明HMF與氨基酸發生了美拉德反應，但不同HMF-氨基酸體系間無顯著性差異(P>0.05)。

表1 HMF-氨基酸體系pH與褐變程度的變化?Table 1 Changes in pH and browning in HMF-Amino acid reaction systems

? 不同字母代表不同體系間差異顯著(P<0.05)。

2.2 HMF對美拉德揮發性成分的影響

將HMF與4種氨基酸反應(2.5 mmol/L HMF+250 mmol/L 氨基酸，160 ℃，15 min)，結果與NIST08.L譜庫比對，HMF-氨基酸反應體系中生成的揮發性物質見表2。在4個反應體系中共鑒定出揮發性成分21種，大多是羰基化合物，包括醛類8種、酮類3種、吡嗪類4種、烴類3種。烴類物質的芳香閾值較高，對食品的風味貢獻不大；醛類和酮類具有綠色植物的香味，在很多美拉德反應中均有檢出，對食品風味有貢獻作用；吡嗪類物質是許多熱加工食品中的重要揮發性成分，具有濃厚的肉香味，是一類特征性風味物質[14]。

在HMF-Ser體系中檢測出5種揮發性物質，5-甲基-2-呋喃甲醛、壬醛、吡嗪是該體系的特征風味物質。在HMF-Thr體系中檢測出10種揮發性物質，特征風味物質是苯乙酮、3-甲基-吡嗪與2,5-二甲基-吡嗪。在HMF-Gaba體系中檢測出5種揮發性物質，特征風味物質是癸醛。在HMF-Ala體系中檢測出7種揮發性物質，特征風味物質是壬醛、癸醛。

在4種氨基酸中，蘇氨酸對風味貢獻較大。HMF-Thr反應體系產生了3種吡嗪類化學物，其中2,5-二甲基-吡嗪、3-甲基-吡嗪的峰面積很大，是HMF-Ser體系產生的吡嗪峰面積的16倍。吡嗪是美拉德反應產生的主要揮發性物質，在非硫氨基酸參與體系中較多，在加熱牛肉的滲出物中甚至達到50%[15]。吡嗪類物質具有堅果、燒烤等氣味，是一種重要的呈香物質，對食品風味具有較大貢獻[16-17]。此外，吡嗪類物質常用作醫藥、香精香料中間體[18]。HMF-Thr反應體系產生的苯乙酮具有香豆素和扁桃的氣味，有甜香尖刺氣息，苦芬芳的風味，在食品中常做香料，主要用于配制櫻桃、葡萄等多種水果和煙草的香精，對食品風味具有積極的貢獻[19]。HMF-Thr反應體系還產生了5種醛類物質，其中癸醛稀釋時有甜橙和橘子香氣，并帶有油脂氣息，壬醛具玫瑰、柑橘等香氣和強的油脂香氣。這些醛類物質是焙烤食品的特征性風味物質[20]，對食品風味均有積極貢獻。

表2 HMF+氨基酸反應體系中的揮發性成分?Table 2 Volatile components produced in HMF-Amino acid reaction systems

? “—”表示未檢出；不同字母代表不同體系間差異顯著(P<0.05)。

HMF-Gaba體系和HMF-Ala體系相比于其他2種氨基酸體系，檢測出的揮發性物質含量較低，可能與不同氨基酸的結構有關。雖然HMF-Ala體系檢測出的揮發性物質含量較低，但產生了香葉基丙酮。香葉基丙酮具有清香，果香，并且有淡雅清新的玫瑰香味。在自然界中存在于茶葉、薄荷、茴香等物質中[21]，該物質廣泛用于香精香料等工業。

2.3 反應物濃度與反應時間對特征性風味物質產生的影響

圖1是HMF-氨基酸體系在不同反應物濃度和不同反應時間下的特征性風味物質的峰面積柱狀圖。在HMF-Ser體系中反應物濃度對風味物質形成量影響很大。由圖1(a)可看出，在不同反應時間(8，15 min)下，高濃度(5 mmol/L HMF+500 mmol/L Ser)體系的吡嗪和5-甲基-2-呋喃甲醛生成量均顯著高于低濃度體系的。但是壬醛只有在長時間(15 min)反應條件下生成量才隨濃度增大而增高。此外，試驗還發現反應時間對這3種特征風味物質的影響只在高濃度體系下較顯著，在低濃度體系中，不同反應時間下它們的生成量沒有顯著性差異。反應15 min時，高濃度體系中吡嗪、5-甲基-2-呋喃甲醛和癸醛的含量分別是低濃度體系的100，10，5倍。說明在HMF-Ser體系中吡嗪、5-甲基-2-呋喃甲醛和壬醛的產生對氨基酸、HMF濃度以及加工時間均有要求。圖1(b)是HMF-Thr體系在不同反應物濃度和不同反應時間下的特征性風味物質的峰面積柱狀圖。由圖1(b)可以得出，在2個底物濃度下，反應15 min比反應8 min產生的苯乙酮、3-甲基-吡嗪、2,5-二甲基-吡嗪的量均顯著增多。而反應物濃度的變化對3種特征性風味物質的影響較小，高濃度下產生的苯乙酮、3-甲基-吡嗪、2,5-二甲基-吡嗪含量僅是低濃度下的1.2～1.5倍。說明在HMF-Thr體系中反應時間是影響苯乙酮與3-甲基-吡嗪生成的唯一因素。在對富含蘇氨酸的食品加工時，通過改變加熱時間，可以調整食品的風味與口感。圖1(c)是HMF-Gaba體系在不同反應物濃度和不同反應時間下的特征性風味物質的峰面積柱狀圖。由圖1(c)可以看出，在相同反應物濃度下，癸醛的生成量隨著反應時間的延長而增多。反應15 min時，癸醛的生成量隨著濃度的增加而增多，而反應8 min時，濃度對于癸醛的生成量沒有顯著性影響。說明反應物濃度和反應時間對癸醛的生成量均有影響，但是反應物濃度要在長時間反應條件下才會有顯著性影響。圖1(d)是HMF-Ala體系在不同反應物濃度和不同反應時間下的特征性風味物質的峰面積柱狀圖。由圖1(d)可知，壬醛、癸醛生成量隨反應時間的延長而增多，但在相同反應時間下，壬醛、癸醛生成量隨濃度增加而減少。通過與HMF-Ser體系、HMF-Gaba體系對比，3個體系中壬醛、癸醛的生成量呈現不同變化趨勢。據此推測反應物濃度和反應時間對壬醛、癸醛生成量的影響可能與參與反應的氨基酸類型及結構關系密切。

不同字母表示不同反應體系間差異顯著(P<0.05)；1為5 mmol/L HMF+500 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，8 min；2為5 mmol/L HMF+500 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，15 min；3為2.5 mmol/L HMF+250 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，8 min；4為2.5 mmol/L HMF+250 mmol/L Ser(a)/Thr(b)/Gaba(c)/Ala(d)，15 min

圖1 反應物濃度與反應時間對HMF-氨基酸體系特征性風味物質產生的影響

圖1 Effect of reactant concentration and reaction time on the production of flavors in HMF-Amino acid reaction systems

3 結論

HMF可與4種氨基酸發生美拉德反應產生揮發性物質，其中吡嗪、3-甲基-吡嗪、苯乙酮、壬醛、癸醛、香葉基丙酮等物質已被證明是美拉德反應體系產生的風味物質，對食品風味均有積極作用。同時，氨基酸與HMF的濃度和反應時間對各反應體系中特征性風味物質的生成量有較大影響。本研究用峰面積定量揮發性物質，后續的研究可以采用內標法處理，以便更精準地分析揮發性物質。