硫辛酸分子印跡膜及其抗氧化效果

楊博文陳玉芹朱秋勁,2

(1. 貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

分子印跡技術(Molecular imprinting technology, MIT)起源于抗體抗原識別理論[1]，能夠識別生物和化學分子，是多功能且具有廣闊前景的技術。由于MIT在聚合過程中形成的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)具有特異性識別位點和記憶模板分子的功能，同時擁有較好的化學穩定性、結構穩定性和預定性，常被用于制作能夠響應外界刺激的智能化學物質和藥物輸送材料[2-3]。刺激響應MIPs可以處理多種形式的釋放或吸附行為，具有響應pH、溫度、離子強度、電場、特定的濃度梯度變化達到調節釋放的效果，MIT是活性包裝發展的一個重要方向[4-6]。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid, ALA)化學名稱為1,2-二硫戊環-3-戊酸，主要存在于微生物細胞、動物肝臟及菠菜等植物之中，是一種抗氧化能力很強的天然抗氧化劑，可清除多種自由基。α-硫辛酸和其還原態產物二氫硫辛酸在生物體內的相互轉化和代謝再生過程中能清除各種類型的自由基，因此被稱作“萬能抗氧化劑”[7-8]。在化妝品中，ALA起阻斷黑色素形成、美白、抗衰老等作用[9]。在食品領域，ALA作為營養補充劑添加至肉雞的飼料中，可以使脂質過氧化程度減少，肉的TBARS值降低，擁有更好的感官性狀[10-11]。部分研究[12-13]也表明，ALA具有很好的抗氧化效果。

由于ALA存在穩定性較差、不耐光和熱、容易在分解過程中產生異味，限制了其在食品領域的應用，使用MIT制作硫辛酸分子印跡聚合物(ALA-MIPs)，可以減少ALA損耗以及異味的產生。除微生物腐敗以外，食品的品質主要受貯藏環境以及脂質氧化的影響，尤其是脂質的多不飽和程度會加劇氧化過程[14]，在高脂肪含量食品的加工、包裝和貯存過程中是導致膳食脂質降解的主要問題。抗氧化劑可以有效地限制氧氣進入肉中，防止脂質氧化和肉類風味品質惡化[15]，將ALA與活性包裝技術結合能夠更有效地起到抗氧化作用[16]。硫辛酸MIPs以異相粒子填充法制備成分子印跡膜(Molecularly imprinted membrane, MIM)，既可以溫敏性釋放ALA，又能夠利用包裝減少氧氣接觸，起到更好的抗氧化效果。分子印跡膜可以運用于肉類、油脂等高脂質食物抗氧化，以及化妝品等多個領域。

本試驗擬采用本體聚合法，以ALA為模板分子，N-乙烯基己內酰胺(NVCL)為溫敏單體和功能單體，制備ALA-MIPs。然后選用聚丙烯腈(PAN)和聚偏氟乙烯(PVDF)作為成膜材料，以異相粒子填充法制備MIM，研究分子印跡膜的機械性能、溫敏性能及抗氧化效果。以期為溫敏性分子印跡膜材料的開發，以及在高油脂含量食品的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料與試劑

α-硫辛酸(ALA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)：99%，美國Sigma-Aldrich公司；

N-乙烯基己內酰胺(NVCL)：98%，美國Sigma-Aldrich公司；

偶氮二異丁腈(AIBN)：99%，阿拉丁試劑有限公司；

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

聚丙烯腈(PAN)：分析純，克拉瑪爾上海譜振生物科技有限公司；

聚偏氟乙烯(PVDF)：99.5%，美國杜邦公司。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀：1260 Infinity II HPLC型，美國安捷倫公司；

微機控制電子萬能試驗機：A2013037型，中國美斯特工業系統有限公司；

標準型接觸角測量儀：DSA25型，德國克呂士公司；

掃描電鏡：Hitachi S-3400N型，日本日立有限公司；

小型涂布機：DP104987型，北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分子印跡聚合物(MIPs)的制備 根據文獻[17]，修改如下：將功能單體改為NVCL，并改變ALA與NVCL的摩爾比例為1∶4。

1.2.2 分子印跡膜(MIM)的制備 使用異相粒子填充膜法[18]，分別稱取一定量預先干燥好的聚丙烯腈(PAN)和聚偏氟乙烯(PVDF)加入到盛有25 mL DMF的錐形瓶中，65 ℃ 恒溫加熱攪拌使之完全溶解，然后加入MIPs，恒溫、恒速攪拌，直到溶液均勻穩定，即得到鑄膜液。將鑄膜液放入真空干燥箱中使其完全脫泡，靜置一段時間。在室溫下用平板涂布機將鑄膜液勻速刮涂在玻璃板上，厚度為0.350 mm，然后將玻璃板置于凝固浴中成膜，浸泡一段時間，期間更換3次洗脫液除去DMF。空白非印跡聚合物膜的制備，除不加MIPs外，其他步驟同上。

1.2.3 膜厚度的測定 膜的厚度使用游標卡尺，隨機測定薄膜的5個位置。

1.2.4 機械性能的測定 按ASTM-D882-91執行，將膜裁成1.8 cm×10 cm的長條，用微機控制電子萬能試驗機測量其厚度并做拉伸測定，夾具間初始距離為60 mm，拉伸速度為1 mm/s，引伸計分辨力為1 μm，測定條件為23.1 ℃，51.7% RH，每組薄膜取5個樣品進行測定，結果取其平均值。拉伸力(TS)和斷裂伸長率(EAB)按式(1)、(2)計算：

(1)

(2)

式中：

TS——拉伸力，N/mm2；

EAB——斷裂伸長率，%；

N——膜斷裂前承受的最大拉伸載荷，N；

a——膜的寬度，mm；

b——膜的厚度，mm；

L0——膜拉伸前長度，mm；

L——膜斷裂前拉伸的長度，mm。

1.2.5 親水性的測定 薄膜的親水性通過接觸角測試進行表征，將水滴(3 μL)小心地滴在膜表面，用接觸角測量儀檢測接觸角。

1.2.6 吸濕率和水溶性的測定 將薄膜充分干燥，取干重為M0的膜在蒸餾水中浸泡 24 h，然后用濾紙迅速吸干表面水分，稱其濕重(M1)，按式(3)計算吸濕率，測定3次取平均值。

(3)

式中：

H——吸濕率，%；

M0——膜的初始重量，g；

M1——膜吸水后的重量，g。

將膜烘干至質量不在發生變化后，量取50 mL蒸餾水倒入小燒杯中，將質量為Wi的膜在室溫下放入蒸餾水中浸漬24 h，瀝去浸漬液后于105 ℃干燥至恒重(Wf)，按式(4)計算水溶性(water solubility，WS)。

(4)

式中：

WS——膜的水溶性，%；

Wi——膜的初始重量，g；

Wf——膜的最終重量，g。

1.2.7 場發射掃描電鏡(SEM) 將膜切成小片粘貼到樣品臺上，然后進行噴金鍍膜處理，最后用掃描電鏡觀察，聚焦清晰后獲取形貌和結構圖像。

1.2.8 分子印跡膜的溫敏釋放特性研究 分別稱取100 mg的分子印跡膜置于25 mL的錐形瓶中，加入5 mL乙腈密封后，將其置于恒溫振蕩器中，分別在15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃溫度下，以70 r/min振蕩24 h后，取1 mL 上層清液，利用HPLC法檢測溶劑中ALA濃度，并按式(5)計算ALA的釋放量。

(5)

式中：

Q——ALA的釋放量，mg/g；

c——乙腈中ALA的濃度，mg/mL；

V——乙腈的體積，mL；

m——分子印跡膜的質量，g。

1.2.9 測定硫辛酸的高效液相色譜(HPLC)條件 檢測器：紫外-可見光檢測器；檢測波長：215 nm；流動相：乙腈與水(用磷酸調pH為3.5，體積比為50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18(4.60 mm×250 mm，5 μm，pH范圍1.0～8.0)。

1.2.10 分子印跡膜過氧化值(POV)的測定 將VE以0.05% 添加到100 g的菜籽油中，分子印跡膜的添加量為1 g，將油樣放于20，40，60 ℃的培養箱中，每隔一定時間測定其POV。植物油中過氧化值按GB 5009.227—2016執行。

1.2.11 DMF的測定 參照文獻[19]。

2 結果與分析

2.1 成膜材料和溶劑的篩選

選擇合適的成膜材料添加比例對膜性能有很大的影響，本研究經過大量試驗，比較了PAN、PVDF 2種成膜材料，選取了在室溫下具有較好成膜特性，且能在平板涂布機上正常涂布的添加比例。PVDF是經FDA許可的食品接觸材料(21 CRF 177.2510)，有較好的重復利用特性，常用于制作水處理超濾膜等，具有很好的安全性。PVDF添加量為8 g/100 g時能夠在凝固浴中較好地成膜，低于這一比例在涂布后不易成膜且厚薄不一；高于12 g/100 g時，無法形成均勻穩定的鑄膜液。PAN則在添加量低于12 g/100 g時，形成的膜脆性較大。因此，在不添加其他添加劑的情況下，本試驗選取2種成膜材料的水平：PVDF為8，10，12 g/100 g；PAN為12，15，20 g/100 g，依次分別記為A、B、C、D、E、F 6個組。

另一個影響膜結構形態和性能的因素是溶劑的選擇，溶劑與成膜材料必須有很好的互溶性且有較好的穩定性。能夠溶解PAN或PVDF的有機溶劑有：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等[20]。本試驗選用吸濕性小，毒性低，價格便宜，且對PAN和PVDF都具有很好溶解性的DMF作為溶劑。DMF性質穩定、可以與多數有機溶劑和水互溶，常被用于醫藥、農藥、石油化工等行業中。制藥工業中，DMF被用于比卡魯胺(Bicalutamide)、比沙可啶( Bisacodyl)、維生素B6和頭孢氨芐等藥物的生產過程[21]；作為溶劑，ICH規定其殘余量不得高于0.88%[22]。制備食品甜味劑三氯蔗糖(TGS)的過程中，由于DMF具有優良的性能，在很多合成方法中被普遍用作溶劑[23-25]。同時，由于DMF很容易被水浴除去，且DMF作為溶劑的殘留量極少，采用HPLC和GC法檢測DMF的檢出限可以達到53 ng[26]，使得DMF適用范圍更加廣泛。本試驗中，未洗脫的PAN膜中DMF的殘余量為0.253 mg/g，PVDF膜中DMF的殘留量為1.52 mg/g，進行3次水浴洗脫處理后，MIM中無DMF殘留。

2.2 薄膜的機械性能研究

機械性能是包裝膜的重要性能指標，食品和保健品包裝需要較高的機械強度以承受運輸保存過程中的外界壓力，圖1 為不同成膜材料對薄膜厚度變化的影響。隨著PVDF添加量的增加，膜的厚度由0.072 mm增加至0.084 mm，鑄膜液濃度對PVDF薄膜的厚度有著較大的影響；同時，加入MIPs之后，PVDF薄膜的厚度明顯增加，可能是加入MIPs使薄膜內產生一些空腔。PAN薄膜的厚度隨著添加量增加進一步降低；添加MIPs后，其厚度有不同程度的上升，這是由于PAN在凝固浴中成膜時，DMF的析出導致表面十分不規則，所以不同部位的厚度差異較大，從圖1中也可看出MIPs組有更大的誤差范圍。

圖1 成膜材料對薄膜厚度的影響Figure 1 Effect of film-forming material on film thickness

從圖2可知，PVDF膜的機械性能整體高于PAN膜，尤其在抵抗形變方面，所有組的拉伸強度都隨著鑄膜液濃度上升而增加，膜的結構變得更為致密，內部結構間相互作用增加。對于PVDF膜而言，隨著濃度上升其斷裂伸長率卻有所下降，可能是內部結晶結構變得更為致密，厚度更大[27]。PAN膜在15 g/100 g的濃度下顯示了最佳的斷裂伸長率，但PAN膜整體的拉伸特性及斷裂伸長率要遠低于PVDF膜。添加MIPs的PVDF薄膜中，其拉伸強度和斷裂伸長率均呈明顯下降趨勢，可能是MIPs破壞了原本的結晶結構，使得原本的連續性被破壞[28]44-47。由于PAN膜本身疏松的結構，加入MIPs對其機械性能影響不大。

2.3 薄膜的接觸角分析

圖3為不同添加比例的PAN和PVDF膜的接觸角圖像。隨著PVDF添加量從8 g/100 g上升至12 g/100 g，接觸角從90.0°下降到83.3°，原因是低濃度鑄膜液在成膜后致密程度較低，表面更為粗糙；隨著MIPs的加入，其接觸角增大，由于MIPs分子無法融于水，還可能堵塞了一些膜表面孔隙，使得接觸角進一步增大。PVDF材料本身具有較強的疏水性，材料表面的粗糙程度的增大會導致疏水性增加[29]。PAN膜表面極為粗糙，接觸角整體小于PVDF，尤其在12 g/100 g 的鑄膜液濃度下，水滴會極快的滲入薄膜中，無法觀測到接觸角。這是由于PAN為親水性材料，低濃度時內部孔隙較大，隨著濃度升高，薄膜聚合物大分子間的相互作用力比聚合物與DMF溶劑之間的相互作用力要強，因此生成的晶核數量增加，膜結構變得密實，膜的孔徑變小，從而膜對純水透過的阻力增大，接觸角也增大[28]20-21。

圖2 成膜材料對薄膜拉伸強度和斷裂伸長率的影響

圖2 Tensile strength and elongation at break of different film-forming composition

圖3 分子印跡膜的接觸角Figure 3 The Contact angle of MIM

2.4 分子印跡膜的吸濕率和水溶性

如圖4所示，PAN膜的吸水性要明顯高于PVDF膜，這是由于PAN膜空氣側表面的孔隙較PVDF膜更大，更為粗糙；吸濕率隨PAN濃度上升而降低，可能是內部空腔減少，水通量增加，導致吸濕率及水溶性減少。PVDF膜的吸濕率隨濃度的增加而上升，這是由于在較低的鑄膜液濃度下，將涂布后的玻璃板浸入凝固浴后，兩相界面處聚合物濃度也低，導致分相后聚合物稀相占有較大的比例，因而膜的有效孔隙率和通量增加，吸濕率也隨之增加[30]。

圖4 成膜材料對薄膜吸濕率和水溶性的影響

圖4 The moisture content and water solubility of different film-forming composition

在薄膜中加入MIPs之后，吸濕率都有所降低，這是由于MIPs粉末不溶于水，親水性也較差，同時MIPs的結構也更為致密，使得水難以透過。同時MIPs的添加也使分子印跡膜的水溶性上升，可能是被嵌合在膜內的MIPs經過長時間浸泡和高溫干燥之后脫落。在PAN(12 g/100 g)和PVDF(12 g/100 g)組中，前者松散的結構往往導致薄膜的物質被水洗脫，后者可能是被截留的溶液析出。

如圖5所示，隨著MIPs添加量的增大，PVDF和PAN組的吸濕率呈相反的變化，推測是2種膜本身結構特性所導致的。PVDF膜的結構十分致密，能夠阻隔水的滲透；PAN膜則恰好相反。添加MIPs后，PVDF膜致密的結構被破壞，導致吸水率增加；而PAN膜內部的孔隙則被MIPs占據，使得其對于水的透過率相對而言有所下降，且MIPs總體的占比上升，使得吸濕率下降。

2.5 薄膜的表面形態表征

薄膜的微觀結構能夠揭示其機械性能、親水性和接觸角變化的原因。圖6為PAN/ PVDF分子印跡膜的掃描電鏡圖。PAN膜的表面要比PVDF粗糙和起伏不平，溶液析出的孔徑遠大于PVDF，但表面材質更為均勻致密，玻璃板側表面十分平滑。PVDF膜玻璃板側表面可見致密的內部孔狀結構，空氣側表面有隨機分布小孔，但數量較少。加入MIPs后形態結構具有以下特點：PVDF表面更為粗糙，小孔減少，不規則縫隙較多，這也揭示了機械性能下降和吸濕性上升的原因；PAN膜表面出現不規則縫隙，孔徑增大，同時也印證了薄膜接觸角變化的原因。PVDF內部空腔結構更為致密，存在大量獨立的小空腔，MIPs被包埋于小空腔內部，不利于ALA釋放；PAN內部的空腔較大，MIPs被包埋于內壁之上，更利于ALA釋放。

2.6 分子印跡膜在不同溫度下的釋放特性

圖7為分子印跡膜在不同溫度下對ALA的釋放量，2種MIM都在20 ℃有釋放量的極大值。NVCL原本的低臨界溫度(LCST)為38 ℃[31]，由于形成了復雜聚合物，合成MIPs后LCST為20～25 ℃。PAN膜的結構更為疏松，使得ALA在PAN分子印跡膜中的釋放量普遍較高。PVDF分子印跡膜的結構相對更為致密，相對PAN膜，各個溫度下的釋放量都較低，但隨著溫度的上升ALA分子向溶液中釋放的量增加，60 ℃時達到最大值，說明在PVDF中，ALA被基膜截留的部分較多，分子擴散運動的加速有利于ALA釋放，與圖6中觀測的結果一致。

2.7 分子印跡膜在植物油中的抗氧化效果

圖8為分子印跡膜在不同溫度下對菜籽油的抗氧化效果，試驗中添加VE作為比對。相比于VE，PVDF膜和PAN膜在所有溫度下都有更低的POV值，但在60 ℃時由于添加量過低和氧化速率加快，MIM抗氧化并不理想。得益于較大的釋放量和溫敏釋放ALA的效果，PAN膜20 ℃組將POV值穩定在較低的區間；40 ℃組到6 d時，POV值增長趨勢略微上升，說明ALA的溫敏性釋放量不足。總體來說，PAN-MIM的抗氧化效果最好，且在20 ℃有最佳抗氧化能力。

圖5 MIPs添加量對分子印跡膜吸濕率和水溶性的影響Figure 5 The moisture content and water solubility of the MIM in different adding amounts

MIPs的緩釋應用和溫敏性能夠展現長期穩定的抗氧化效果，同時其特異性識別和反復利用特性使得MIT在食品領域的應用范圍不斷拓寬，從對食品中各種有毒物質、農藥殘留和添加劑的快速檢測，發展到食品的預處理、去除食品中有害物質以及作為食品包裝，如清除和預濃縮牛奶和鮮蝦樣品中的氯霉素和磁性納米粒子食品包裝，都體現了MIPs在食品領域的重要作用[32-33]。

圖6 分子印跡膜的掃描電鏡圖Figure 6 The SEM images of MIM

圖7 分子印跡膜在不同溫度下的釋放特性Figure 7 Release characteristics of the MIM at different temperatures

圖8 添加MIM的菜籽油在20，40，60 ℃下的POV值Figure 8 The POV value of rapeseed oil in 20, 40 and 60 ℃ adding MIM

3 結論

本試驗對制備的分子印跡膜的親水性、機械性能、溫敏性以及抗氧化性能進行表征，發現PAN和PVDF膜分別體現了較強的親水性和疏水性，PVDF有更好的機械性能。PAN在添加量為20 g/100 g，MIPs添加量為2 g時機械性能較好，且吸濕率較低。2種MIM都在20 ℃左右對ALA表現出優異的溫敏性釋放，從而可實現對ALA的基于溫度變化的控制釋放， PVDF膜由于內部結構的截留，在60 ℃有最大釋放量。PAN膜總體釋放量更大，在菜籽油中的POV值低于VE，抗氧化效果最好。目前還沒有學者對溫敏性分子印跡抗氧化膜以及在食品包裝上的應用進行相關研究，此項研究的重點在于開發具有溫敏特性的分子印跡膜，利用其緩釋特性釋放抗氧化劑，并將其應用于食品的抗氧化當中。但是要制備出對不同溫度段響應并且緩釋抗氧化劑的分子印跡膜還需要做大量的工作：在溫敏性能上，對不同溫度段進行響應的MIPs及功能單體還需要進一步探索與研究；MIM中ALA的遷移機制、釋放動力學和抗氧化效果的聯系有待進一步研究。