硫辛酸麥角甾醇酯的制備及抗氧化作用

唐小卉 紀蘇萍 夏 雪 賈承勝

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

麥角甾醇是一種在麥角和真菌中發現的純天然類固醇，存在于大部分真菌中[1]。麥角甾醇是維生素D2的前體，在光解和熱重排后可以轉變為維生素D2[2]。研究表明，麥角甾醇具有多種生理功能，如抗高血脂[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]等。Hu等[3]發現榆黃菇的乙酸乙酯提取物和甲醇提取物在大鼠體內具有顯著的抗高脂血癥作用，而麥角甾醇是其主要成分之一。Schneider等[6]發現平菇能有效調節人體血液參數(甘油三酯、總膽固醇、氧化低密度脂蛋白)，可能是由于亞油酸、麥角甾醇和麥角甾醇衍生物的存在。此外，麥角甾醇及其衍生物能夠抑制黑素生成和表皮細胞增殖[7]。但在實際使用過程中，麥角甾醇的油溶解性差，應用范圍有限。據報道[8]，通過與脂溶性成分(如脂肪酸)酯化，甾醇的親脂性能夠得到改善。

硫辛酸是一種非常重要的維生素B族化合物，主要存在于動物肝臟以及番茄和胡蘿卜等植物中。在體內，硫辛酸可以被還原為有2個巰基的二氫硫辛酸，二者在脂溶性和水溶性環境中均能發揮抗氧化性，可以毫無障礙地在身體內游走，到達每一個細胞，被認為是天然的萬能抗氧化劑。硫辛酸因強抗氧化性在國內外醫藥領域早已得到廣泛使用，用于預防由身體中的自由基引起的衰老和一些其他疾病，如糖尿病、癌癥、心血管疾病和炎癥[9-11]。

國內外對于麥角甾醇的改性研究已有報道。Chaibakhsh等[7]采用酶法合成了油酸麥角甾醇酯；He等[12]在無溶劑體系中通過直接酯化法合成了月桂酸麥角甾醇酯；Lin等[13]合成了糠酸麥角甾醇酯、水楊酸麥角甾醇酯和2-萘甲酸麥角甾醇酯。但對麥角甾醇進行酯化改性增效以提高其抗氧化性未見有報道。本研究擬以麥角甾醇和硫辛酸為原料，通過化學法在常溫條件下合成硫辛酸麥角甾醇酯，并考察硫辛酸麥角甾醇酯對食用油氧化穩定性的影響，旨在開拓麥角甾醇及其衍生物在食品、生物醫藥和化妝品中的應用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

麥角甾醇：純度>95%，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

硫辛酸：純度>95%，西安常恒醫藥有限公司；

甾醇阿魏酸酯：純度>95%，實驗室自制；

4-二甲胺基吡啶(DMAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)：分析純，中國醫藥(集團)上海化學試劑公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

碘化鉀：分析純，無錫市展望化工試劑有限公司；

金龍魚菜籽油、金龍魚大豆油：上海益海嘉里食品工業有限公司；

薄層色譜硅膠板：5 cm×10 cm，青島海洋化工廠；

柱層析硅膠：200～300目，青島海洋化工廠。

1.1.2 主要儀器設備

循環水式多用真空泵：SHB-D (III)型，科瑞儀器有限責任公司；

智能自動磁力恒溫加熱攪拌器：DF-101S型，科瑞儀器有限責任公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：Nicolet iS10型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

超聲波清洗儀：SK5210HP型，上海科島超聲儀器有限公司；

恒溫數顯水浴鍋：HH-S2型，常州市拓興實驗儀器廠；

高效液相色譜儀：Waters 1525型，沃特世科技(上海)有限公司；

旋轉蒸發儀：R210型，瑞士步琦有限公司；

層析柱：100 cm×Φ2.5 cm型，上海市達豐有限公司；

可見光分光光度計：T6型，北京普析通用儀器有限責任公司；

磁力攪拌器：IKA c-MAG HS-7型，德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 硫辛酸麥角甾醇酯的制備 稱取一定量的硫辛酸和麥角甾醇于三角燒瓶中，向其中加入適量的二氯甲烷，再加入適量的催化劑，于室溫25 ℃下反應20 h。待反應結束之后，使用旋轉蒸發儀蒸干去除溶劑，所得反應物經柱層析(硅膠200～300目)分離后，得到純化的硫辛酸麥角甾醇酯。將制得的產物真空干燥后進行結構鑒定，確定其結構并證實產物為硫辛酸麥角甾醇酯。

1.2.2 硫辛酸麥角甾醇酯的反應條件優化 主要選取影響麥角甾醇酯化的5個因素：催化劑種類(DMAP/EDC/Et3N、DMAP/DCC、十二烷基硫酸、無水硫酸氫鈉、對甲基苯磺酸、十二烷基苯磺酸)、麥角甾醇濃度(50，60，70，80，90，100 mmol/L)、催化劑濃度(DMAP濃度：8，16，24，32，40 mmol/L；EDC濃度：80，88，96，104，112 mmol/L；Et3N濃度：96，104，112，120，128 mmol/L)、硫辛酸與麥角甾醇的摩爾比(1.5，2.0，2.5，3.0，3.5)和反應時間(18，19，20，21，22 h)。固定參數：反應溫度25 ℃、溶劑二氯甲烷、復合催化劑種類DMAP/EDC/Et3N、麥角甾醇濃度80 mmol/L、麥角甾醇與DMAP/EDC/Et3N摩爾比1.0∶0.2∶1.2∶1.5、硫辛酸與麥角甾醇的摩爾比1.5、反應時間18 h，分別改變其中一因素，進行單因素試驗，研究其對硫辛酸麥角甾醇酯化率的影響，得出最優反應條件。

1.2.3 酯化率的測定

(1) 繪制標準曲線：將酯化反應所得的純硫辛酸麥角甾醇酯配制成0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mg/mL的石油醚/正己烷(體積比1∶1)溶液，通過高效液相色譜法(HPLC)測定各濃度的硫辛酸麥角甾醇酯的峰面積，將峰面積對數值和濃度對數值進行線性擬合，得標準曲線、線性擬合常數和方程式。將反應液進樣之后，將產品峰面積代入標準曲線方程式(1)計算反應液中產品的濃度。

lgA=1.558×lgC+6.91(R2>0.99)，

(1)

式中：

A——相應的組分峰面積；

C——組分的濃度，mg/mL。

(2) 酯化率的測定：酯化率是酯化反應實際生成的產物量和理論上應生成產物量的百分比，按式(2)計算。

(2)

式中：

c1——硫辛酸麥角甾醇酯的濃度，mol/L；

c2——反應開始麥角甾醇的濃度，mol/L；

K——硫辛酸麥角甾醇酯的酯化率，%。

1.2.4 產物的HPLC分析 分析方法：使用C18色譜柱，流動相是體積分數0.1%的甲酸-甲醇溶液(色譜純)，樣品溶于甲醇和正己烷的混合溶液(體積比8∶1)，流動相的流速為1.0 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃，進樣量為10 μL，柱壓為0.5 MPa。蒸發光檢測器的檢測條件：載氣為N2，流速為1.5 L/min，溫度為55 ℃，噴霧級別為75%，增益為1。

1.2.5 產物的結構鑒定 采用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析法，具體方法為：采用KBr壓片法制片，掃描范圍600～4 000 cm-1，掃描次數32次，分辨率4 cm-1。

1.2.6 產物的溶解性和抗氧化作用的研究

(1) 油溶性的測定：精確稱取200 mg的硫辛酸、麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯和硫辛酸麥角甾醇酯于三角燒瓶中，30 ℃油浴并攪拌，每30 min加入1 mL大豆油，觀察其溶解狀態。至未溶解的懸浮顆粒開始減少時，每30 min加入大豆油的量改為0.5 mL。待未溶解的懸浮顆粒明顯減少時，加入大豆油的速度改為0.1 mL/30 min，直至懸浮顆粒完全溶解。記錄完全溶解200 mg樣品所用大豆油的量。各物質30 ℃時的油溶性可通過加入大豆油的量來計算，單位為g/L。

(2) 過氧化值的測定：按GB 5009.227—2016的滴定法。根據食品添加劑使用標準(GB 2760—2014)，按0.2 g/kg 分別將硫辛酸、麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯、硫辛酸麥角甾醇酯添加到適量的菜籽油中，將無添加的菜籽油作為空白對照組。當過氧化值超過0.25 g/100 g時，停止測定，計算結果處理數據。

測定不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯過氧化值：分別按照0.1，0.2，0.3，0.4 g/kg將硫辛酸麥角甾醇酯添加到適量的菜籽油中，使用上述方法測定其過氧化值。按式(3)計算過氧化值。

(3)

式中：

X1——過氧化值，g/100 g；

V——試樣消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積，mL；

V0——空白試驗消耗的硫代硫酸鈉標準溶液體積，mL；

c——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；

0.126 9——與1.00 mL硫代硫酸鈉標準溶液[c(Na2S2O3)=1.000 mol/L]相當的碘的質量；

m——試樣質量，g；

100——換算系數。

(3) DPPH·清除活性的測定：分別測定麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯和硫辛酸麥角甾醇酯的DPPH·清除率。具體方法：將待測樣品分別配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L的甲醇/正己烷(體積比8∶1)溶液，然后將1 mL的待測樣品溶液和5 mL的0.1 mmol/L DPPH·乙醇溶液分別加入同一試管中，搖勻，蓋上塞子，于25 ℃避光反應15 mim，于517 nm 波長下測定樣品的吸光值；同時取1 mL待測樣品溶液與5 mL無水乙醇的混合溶液，于517 nm波長下測定其吸光值；取1 mL甲醇/正己烷溶液與5 mL 0.1 mmol/L DPPH·的乙醇溶液混勻后測定吸光值。按式(4)計算DPPH·清除率。

(4)

式中：

C——DPPH·清除率，%；

Ai——待測樣品溶液反應后的吸光值；

Aj——待測樣品溶液與無水乙醇混合溶液的吸光值；

Ac——甲醇/正己烷溶液與DPPH·的乙醇溶液混合溶液的吸光值。

2 結果與分析

2.1 產物分析和結構鑒定

2.1.1 高效液相色譜分析 如圖1所示，反應液的組分被分離且分離效果較好，硫辛酸、麥角甾醇、硫辛酸麥角甾醇酯的保留時間分別為1.63，3.33，6.08 min。經分離純化后的產物純度為94%。

圖1 酯化反應混合物HPLC圖Figure 1 HPLC chromatograms of esterification reaction mixture

2.1.2 傅里葉變換紅外線光譜分析 紅外光譜主要用來檢測分子的振動類型并確定分子內所含基團及化學鍵的類型。對比文獻[12]中的麥角甾醇FTIR圖，由圖2可知，在1 732 cm-1處出現C═O伸縮震動峰，1 173 cm-1處出現C—O—C伸縮震動峰，確定有酯鍵生成，由此可判斷有硫辛酸麥角甾醇酯生成。

圖2 硫辛酸麥角甾醇酯的傅立葉變換紅外光譜圖Figure 2 FT-IR spectra of ergosteryl lipoate

2.2 酯化條件優化

2.2.1 催化劑種類的影響 由圖3可知，在所選的6種催化劑中，只有DMAP/EDC/Et3N和DMAP/DCC具有較高的催化活性，酯化率分別達到了32.1%和27.9%，而其它無機催化劑酯化率均小于1%。雖然在此反應中DMAP/EDC/Et3N的催化效率與DMAP/DCC相差不大，但DCC吸水后生成的DCU固體顆粒抽濾時不易去除，且溶解性差，增加了后期分離純化的難度。相比之下，EDC轉化成的EDU在有機溶劑和水中溶解性都非常好，柱層析時可溶于洗脫劑中，經柱層析分離后便可完全除去。因此，選擇DMAP/EDC/Et3N作為催化劑。

2.2.2 麥角甾醇濃度的影響 由圖4可知，麥角甾醇濃度低于80 mmol/L時，酯化率隨麥角甾醇濃度的增加而顯著增大；高于80 mmol/L時，酯化率隨麥角甾醇濃度的增加而略有減小。可能是麥角甾醇濃度低于80 mmol/L時，其濃度增加，反應物與催化劑間碰撞幾率增大，促進反應的進行；而高于80 mmol/L時，反應物濃度的增加使得體系黏度增大，反應物與催化劑間碰撞幾率減小，導致酯化率降低。因此，麥角甾醇的濃度選擇80 mmol/L。

A. DMAP/EDC/Et3N B. DMAP/DCC C. 十二烷基硫酸 D. 無水硫酸氫鈉 E. 對甲基苯磺酸 F. 十二烷基苯磺酸

圖3 催化劑種類對酯化率的影響

圖3 Effect of catalyst type on esterification rate

圖4 麥角甾醇濃度對酯化率的影響Figure 4 Effect of ergosterol concentration on esterification rate

2.2.3 催化劑用量的影響 由圖5～7可知：

(1) 隨著DMAP濃度的增加，酯化率先增后減，DMAP濃度為16 mmol/L時，酯化率最高。原因可能是DMAP的濃度小于16 mmol/L時，麥角甾醇與DMAP的碰撞幾率會隨DMAP濃度的增加而增大，促進反應的進行；而大于16 mmol/L時，生成大量的中間產物，影響反應的進行，導致酯化率的下降。

圖5 DMAP濃度對酯化率的影響Figure 5 Effect of DMAP concentration on esterification rate

圖6 EDC濃度對酯化率的影響Figure 6 Effect of EDC concentration on esterification rate

圖7 Et3N濃度對酯化率的影響Figure 7 Effect of Et3N concentration on esterification rate

(2) 隨著EDC濃度的增加，酯化率明顯增加，當EDC濃度大于96 mmol/L后，酯化率基本無變化。原因可能是原反應溶劑水分去除不徹底，中間產物也可能產生一部分水，需過量的EDC加以去除。

(3) 隨著Et3N濃度的增加，酯化率增加，當Et3N濃度大于120 mmol/L后，酯化率不變。

綜上所述，DMAP、EDC、Et3N的最佳用量分別為16，96，120 mmol/L，即麥角甾醇與DMAP/EDC/Et3N的最佳用量摩爾比為1.0∶0.2∶1.2∶1.5。

2.2.4 酸醇摩爾比的影響 由圖8可知，當硫辛酸與麥角甾醇的摩爾比為2∶1時，反應酯化率達到最大，可能是在適當的濃度下，酸醇摩爾比的增加可以使2種反應物分子的碰撞幾率增加，有利于反應平衡的正向移動；但當硫辛酸的濃度過高時，反應體系黏度增加，降低了反應物之間、反應物與催化劑之間的接觸效率，導致酯化率的降低。因此，酸醇摩爾比選擇2∶1。

2.2.5 反應時間的影響 由圖9可知，隨著反應時間的延長，硫辛酸麥角甾醇酯的酯化率先增后不變，可能是反應時間低于20 h時，溶液中的麥角甾醇并未被完全消耗；而反應進行到20 h左右時，麥角甾醇完全轉化為硫辛酸麥角甾醇酯或中間產物，酯化率趨于穩定。因此，反應時間選擇20 h。

根據以上優化結果，得到酯化最優工藝條件為：以DMAP/EDC/Et3N為催化劑，麥角甾醇濃度80 mmol/L，硫辛酸∶麥角甾醇∶DMAP∶EDC∶Et3N摩爾比2∶1∶0.2∶1.2∶1.5，溶劑二氯甲烷，反應溫度25 ℃，反應時間20 h。采用以上條件進行酯化反應，分別經3次平行試驗得到硫辛酸麥角甾醇酯的平均酯化率為91.3%。

圖8 酸醇摩爾比對酯化率的影響Figure 8 Effect of molar ratio of reactants on esterification rate

圖9 反應時間對酯化率的影響Figure 9 Effect of reaction time on esterification rate

2.3 產物性質的研究

2.3.1 油溶性 研究了在30 ℃時，麥角甾醇和硫辛酸麥角甾醇酯在大豆油中的溶解度。由于阿魏酸、硫辛酸同為強抗氧化劑，甾醇阿魏酸酯具有良好的油溶性和抗氧化性，且國內外對甾醇阿魏酸酯的研究較多，因此本試驗選取甾醇阿魏酸酯作為參照物。由表1可知，進行酯化反應后，產物硫辛酸麥角甾醇酯的油溶性相較于麥角甾醇提升明顯，與甾醇阿魏酸酯相當，可能是與硫辛酸發生酯化反應，引入了親脂基團，在很大程度上改善了麥角甾醇的油溶解性，擴大了其應用范圍。這與以前報道[14]的植物甾醇脂肪酸酯的試驗結果一致。

表1 反應物、產物與甾醇阿魏酸酯在大豆油中的溶解度

2.3.2 抗氧化性

(1) 添加不同物質的菜籽油過氧化值測定：本研究考察了硫辛酸、麥角甾醇、硫辛酸麥角甾醇酯、甾醇阿魏酸酯的添加對菜籽油氧化過程的影響，選取甾醇阿魏酸酯作為參照物。由圖10可知，菜籽油的過氧化值與時間基本呈線性相關；試驗所用添加物可明顯延緩菜籽油的氧化過程，經過酯化改性的麥角甾醇抗氧化功能明顯高于麥角甾醇，略低于硫辛酸，略高于甾醇阿魏酸酯。硫辛酸具有強抗氧化性，且其抗氧化性高于麥角甾醇，因此硫辛酸麥角甾醇酯的抗氧化性應高于麥角甾醇但低于游離硫辛酸本身。

(2) 添加不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯的菜籽油過氧化值測定：由圖11可知，隨著添加硫辛酸麥角甾醇酯濃度的增大，菜籽油過氧化值有明顯降低，且添加量在0.3 g/kg左右時，提升較為明顯，這可為其在食用油中的添加提供一定參考。

圖10 添加不同抗氧化劑的菜籽油的過氧化值Figure 10 The peroxide value of rapeseed oil with different antioxidants

圖11 添加不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯菜籽油的過氧化值

圖11 The peroxide value of rapeseed oil with different concentration of ergosteryl lipoate

(3) DPPH·清除能力的測定：考察了不同濃度的麥角甾醇和麥角甾醇硫辛酸酯對DPPH·的清除能力，選取甾醇阿魏酸酯作為參照物。由圖12可知，在試驗濃度范圍內(0.2～1.0 g/L)，麥角甾醇對DPPH·的清除能力隨濃度變化較小，硫辛酸麥角甾醇酯對DPPH·的清除能力較麥角甾醇有較大提升，且隨著濃度的增加明顯增強，當濃度在1.0 g/L時，其抗氧化能力接近甾醇阿魏酸酯。

圖12 不同濃度的麥角甾醇、甾醇阿魏酸酯、硫辛酸麥角甾醇酯對DPPH·清除率

圖12 The DPPH radical clearance rates of ergosterol, sterol ferulate and ergosteryl lipoate at different concentrations

3 結論

通過麥角甾醇與硫辛酸的酯化對麥角甾醇進行了改性，提高了其在食用油中的溶解度和抗氧化性，從而擴大了麥角甾醇在食品工業中的應用范圍。產物硫辛酸麥角甾醇酯在菜籽油中的溶解度為19.81 g/L，相較于麥角甾醇的9.76 g/L有了很大改善，表明甾醇酯化后其脂溶性成分能改善甾醇的親脂性。硫辛酸和麥角甾醇均具有一定的抗氧化性，酯化后的產物硫辛酸麥角甾醇酯抗氧化能力優于改性前的麥角甾醇，與甾醇阿魏酸酯處在同一水平。通過對添加不同濃度硫辛酸麥角甾醇酯的菜籽油的過氧化值測定，得到0.3 g/kg為較好的添加量，可明顯提高食用油的抗氧化性，可為其實際應用提供一定依據。目前，對于麥角甾醇改性國內外研究較少，這意味著將改性麥角甾醇應用于食品工業還很遙遠，麥角甾醇的改性和品質優化還有待進一步研究。