荸薺皮酚類物質(zhì)超聲波輔助提取工藝優(yōu)化

詹 歌 李凱凱 孫艷輝 龍 門

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000)

酚類物質(zhì)是一類以苯酚為基本骨架并攜有多個羥基的芳香環(huán)類有機(jī)化合物，可分為酚酸類和黃酮類[1]1-3。其廣泛存在于水果、蔬菜、谷物、豆類等植物體內(nèi)，含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物。由于酚類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗突變、抗脂質(zhì)過氧化、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化、抗病毒及抑制HIV復(fù)制等多種生物活性，因此被形象地稱為“一座有待開發(fā)的金礦”[2-4]。

提取是研究酚類物質(zhì)的關(guān)鍵步驟，針對不同植物、不同部位酚類的提取采用的方法有所不同。目前酚類物質(zhì)的提取物方法中，溶劑提取法和熱水提取法等傳統(tǒng)方法仍占主導(dǎo)地位，但其能耗大，提取時間長，所需溫度高，不利于酚類活性的保護(hù)，產(chǎn)品得率低。超聲波輔助提取是在原溶劑提取的基礎(chǔ)上加以超聲波處理的提取過程。超聲波可以顯著加速傳質(zhì)的過程，容易實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用[5-7]。與傳統(tǒng)的提取方式相比，具有提取效率高、污染小等優(yōu)勢。

荸薺皮是荸薺加工及食用后的下腳料，絕大多數(shù)被用作農(nóng)戶肥料或以廢物的形式丟棄，未能得到合理利用。因此，對荸薺皮進(jìn)行開發(fā)利用，不僅能夠解決環(huán)境污染問題，而且具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。荸薺中富含多種酚類物質(zhì)[8-9]，目前關(guān)于荸薺皮總黃酮提取的研究較少，僅羅楊合等[10]采用正交分析法研究了超聲輔助提取荸薺皮總黃酮的工藝條件；高山等[11]采用響應(yīng)面分析法對荸薺皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，且二者在最優(yōu)條件下總黃酮提取率均不超過1.5%，而對荸薺皮總酚提取工藝的研究尚未見報道，本研究擬采用響應(yīng)面分析法對超聲輔助提取荸薺皮中總酚和總黃酮的工藝條件同時進(jìn)行優(yōu)化，旨在為其工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺皮：收集于南京童衛(wèi)路菜市場，50 ℃熱風(fēng)干燥8 h，粉碎后放于干燥的室溫環(huán)境下備用；

沒食子酸、蘆丁、Folin-Ciocalteu：純度>98%，美國Sigma公司；

無水乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯：國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9240 MBE型，上海博迅實業(yè)有限公司；

電子天平：JA1203型，上海良平儀器儀表有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-3000E型，江蘇昆山超聲儀器有限公司；

予華牌循環(huán)水式真空泵：SHZ-D (Ⅲ)型，鞏義市英予華儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-201型，上海申盛生物有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-L型，國華電器有限公司；

紫外分光光度計：UV1800型，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 荸薺皮酚類物質(zhì)的提取 準(zhǔn)確稱取荸薺皮粉1 g，按照設(shè)定的溶劑種類、料液比、提取溫度、超聲功率、超聲時間提取后，真空抽濾，將濾液用30%乙醇定容至適宜體積，備用。

1.3.2 總酚含量 (total phenolic content, TPC) 測定 采用Folin-Ciocalteu法并參考文獻(xiàn)[12]修改如下：吸取濃度為0.17 mg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 分別置于10 mL容量瓶中，各加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑和3 mL去離子水，再各加1.0 mol/L的NaCO3溶液2 mL，搖勻后靜置60 min，用去離子水稀釋至刻度，于760 nm處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，并計算回歸方程。取供試樣品溶液1 mL同上法測定，測量結(jié)果以毫克沒食子酸當(dāng)量每克荸薺皮表示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of gallic acid solution

1.3.3 總黃酮含量 (total flavonoid content, TFC) 的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法并參考文獻(xiàn)[13]修改如下：精密吸取0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，各加入50%乙醇至5 mL，精確加入5% NaNO20.3 mL，搖勻靜置6 min，再加入10% Al(NO3)30.3 mL，搖勻靜置6 min，最后加入4% NaOH溶液4 mL，用50%乙醇定容，搖勻后放置15 min，于510 nm 下測吸光值，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，并計算回歸方程。取供試樣品溶液1 mL 同上法測定，測量結(jié)果以毫克蘆丁當(dāng)量每克荸薺皮表示。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of rutin solution

1.3.4 單因素試驗

(1) 溶劑種類對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響：準(zhǔn)確稱取1 g荸薺皮，按料液比1∶15 (g/mL)分別加入水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯5種溶劑并在提取溫度50 ℃、超聲功率240 W作用40 min。將浸提液過濾定容后測定總酚和總黃酮含量，3次平行試驗取平均值。

(2) 料液比對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響：準(zhǔn)確稱取1 g荸薺皮粉，分別按料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL) 加入甲醇，在提取溫度50 ℃、超聲功率240 W 作用40 min，將提取液過濾定容后測定總酚和總黃酮含量，3次平行試驗取平均值。

(3) 提取溫度對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響：準(zhǔn)確稱取1 g荸薺皮，按總酚提取料液比1∶15 (g/mL)，總黃酮提取料液比1∶20 (g/mL) 加入甲醇，分別在提取溫度40，45，50，55，60 ℃，超聲功率240 W作用40 min，將提取液過濾定容后測定總酚和總黃酮含量，3次平行試驗取平均值。

(4) 超聲功率對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響：準(zhǔn)確稱取1 g荸薺皮，按總酚提取料液比1∶15 (g/mL)，總黃酮提取料液比1∶20 (g/mL)加入甲醇，在提取溫度55 ℃，超聲功率分別為180，210，240，270，300 W作用40 min，將提取液過濾定容后總酚和總黃酮含量，3次平行試驗取平均值。

(5) 超聲時間對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響：準(zhǔn)確稱取1 g荸薺皮，在提取溫度55 ℃，總酚提取料液比1∶15 (g/mL)，超聲功率270 W，總黃酮提取料液比1∶20 (g/mL)，超聲功率240 W的條件下研究超聲時間分別為20，30，40，50，60 min對荸薺皮總酚和總黃酮提取效果的影響。最后將提取液過濾定容后測定總酚和總黃酮含量，3次平行試驗取平均值。

1.3.5 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以總酚含量和總黃酮含量為響應(yīng)值，以料液比、提取溫度、超聲功率、超聲時間為考察因素進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，對試驗結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，并加以驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溶劑種類對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響 植物原料組分的溶解性能與溶劑性質(zhì)有密切相關(guān)性。因此選擇合適的提取溶劑則更有利于荸薺皮中總酚和總黃酮的提取。

由表1可知，不同溶劑提取對荸薺皮總酚和總黃酮的得率有較大的影響。其中甲醇作為提取劑時總酚和總黃酮的含量顯著高于其它溶劑，分別達(dá)到(3.13±0.09)，(13.21±0.21) mg/g。這主要是甲醇具有較強(qiáng)的擴(kuò)散作用和滲透功能[14]，能夠逐漸透過細(xì)胞壁進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，溶解可溶性的組分。故選用甲醇來提取荸薺皮中的酚類物質(zhì)。

表1 溶劑種類對總酚和總黃酮含量的影響?Table 1 Effect of different solvent kinds on TPC and TFC (n=3) mg/g

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

黃酮類化合物是種類和含量最為豐富的酚類化合物[1]15-17，然而在本試驗中，分別采用Folin-Ciocalteu法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定同一樣品的總酚和總黃酮含量時發(fā)現(xiàn)，總酚含量明顯低于總黃酮含量，一方面是這2種方法本身存在一定的局限性，包括不能排除雜質(zhì)的干擾，容易過高或過低估計各種化合物λmax的不同[15]；另一方面還可能是荸薺皮中的酚類物質(zhì)與總酚含量測定的標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸的結(jié)構(gòu)差異較大，而與總黃酮含量測定的標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的結(jié)構(gòu)更為相似。因此，這2種方法并不能對樣品中的酚類物質(zhì)進(jìn)行精確定量，但卻常被用來快速比較不同樣品間的總酚和總黃酮含量差異[16]。

2.1.2 料液比對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響 由圖3可知，隨著溶劑用量的增大，荸薺皮總酚和總黃酮的含量也逐漸增大，當(dāng)料液比分別達(dá)到1∶15，1∶20 (g/mL) 時，總酚和總黃酮含量均達(dá)到最大值，分別為(3.14±0.10)，(14.13±0.29) mg/g，之后隨溶濟(jì)用量繼續(xù)增大，總酚和總黃酮的含量基本保持不變。說明當(dāng)酚類和黃酮類物質(zhì)在溶劑中的溶解量達(dá)到飽和狀態(tài)后，繼續(xù)增加溶劑用量，并不能顯著提高總酚和總黃酮的含量，考慮到溶劑用量和能量消耗等經(jīng)濟(jì)成本，確定總酚和總黃酮提取的料液比分別在1∶15，1∶20 (g/mL) 左右比較合理。

2.1.3 提取溫度對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響 提高

圖3 料液比對總酚和總黃酮含量的影響Figure 3 Effect of ratio of liquid to solid on TPC and TFC

溫度是增大原料成分的溶解度，加快溶出速率的有效途徑，但過高的溫度可能會導(dǎo)致預(yù)提取物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)破壞，同時造成大量的溶劑揮發(fā)，增加損失。因此選擇合適的提取溫度能夠有效地獲取原料中的活性成分。

由圖4可知，總酚和總黃酮含量隨著溫度的升高而穩(wěn)步上升，在60 ℃時均到達(dá)最大值。這主要是在提取過程中，溫度的升高加快了分子的運(yùn)動速度，同時也加快了滲透、擴(kuò)散、溶解的速度，使酚類和黃酮類物質(zhì)更容易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到溶劑中[17]。因此選取提取溫度55 ℃為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗。

圖4 提取溫度對總酚和總黃酮含量的影響Figure 4 Effect of extracting temperature on TPC and TFC

2.1.4 超聲功率對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響 由圖5可知，當(dāng)超聲功率在180～270 W時，總酚含量增長幅度均比較明顯。在270 W時總酚含量最大，為(4.26±0.10) mg/g，之后總酚含量呈下降趨勢。總黃酮的提取效果與總酚的提取效果類似，當(dāng)功率達(dá)240 W時，總黃酮含量最高達(dá)(15.03±0.08) mg/g。但隨著功率的繼續(xù)增大，總黃酮含量也開始降低。造成這種現(xiàn)象的原因一方面是高功率超聲波空化作用在破壞細(xì)胞壁的同時也破壞了酚類和黃酮類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；另一方面是一些醇溶性雜質(zhì)溶出量增加，與預(yù)提物質(zhì)競爭同甲醇分子的結(jié)合。因此，分別選取270，240 W作為總酚、總黃酮提取的最佳超聲功率。

2.1.5 超聲時間對荸薺皮總酚和總黃酮含量的影響 超聲時間太短影響提取效果，太長又不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此合適的提取時間既可以得到最優(yōu)的提取效果也可以節(jié)約時間及節(jié)省能源[18]。由圖6可知，隨著超聲時間的延長，荸薺皮總酚和總黃酮含量增加，當(dāng)超聲時間為50 min 時，總酚和總黃酮的含量均達(dá)到最高，分別為(4.35±0.08)，(15.42±0.07) mg/g。繼續(xù)延長超聲時間，總黃酮含量幾乎保持恒定，而總酚卻開始下降。理論上講，提取時間越長，酚類物質(zhì)提取越充分，但由于其穩(wěn)定性較差，在超聲波振蕩的過程中，會與氧氣充分接觸而被氧化、聚合，從而導(dǎo)致總酚提取效果的減弱。所以取50 min為最優(yōu)的超聲時間。

圖5 超聲功率對總酚和總黃酮含量的影響Figure 5 Effect of ultrasonic power on TPC and TFC

圖6 超聲時間對總酚和總黃酮含量的影響Figure 6 Effect of ultrasonic time on TPC and TFC

2.2 響應(yīng)面法試驗分析

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，采用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化荸薺皮總酚及總黃酮提取工藝，試驗因素及水平取值見表2，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3。

運(yùn)用Design Expert 8.0統(tǒng)計軟件對表3的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得TPC(Y1)與TFC(Y2)與4個因素的二次多項式回歸模型分別為：

(1)

(2)

表2 總酚及總黃酮試驗設(shè)計因素和水平編碼值Table 2 Factors and levels of experiment design of total phenolic content (TPC) and total flavonoid content (TFC)

表3 總酚及總黃酮Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment of total phenolic and total flavonoid

由總酚(表4)和總黃酮(表5)回歸模型的方差分析可看出，2個模型的P值均小于0.000 1，說明各響應(yīng)值對該模型的影響是極顯著的，具有統(tǒng)計學(xué)意義；且失擬項均不顯著(P>0.05)，說明該回歸方程與試驗擬合程度較好，可以用該回歸方程代替試驗真實點(diǎn)對試驗結(jié)果進(jìn)行分析；決定系數(shù)R2分別為0.952 2，0.963 6，表明TPC和TFC與4個自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著且試驗誤差較小，因此可分別對總酚和總黃酮提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4 總酚回歸模型的方差分析?Table 4 Variance analysis of regression model of total phenolic

? *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

表5 總黃酮回歸模型的方差分析?Table 5 Variance analysis of regression model of total flavonoid

? *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2 因素交互作用 由圖7可知，當(dāng)提取溫度較低時，隨著溶劑用量的增大，TPC逐漸增大并趨于平緩；而當(dāng)提取溫度較高時，TPC隨料液比的增大呈先增大后減小的趨勢；溶劑用量較少，提取時隨著提取溫度的升高，TPC逐漸增加并趨于平緩；而溶濟(jì)用量較多提取時，若提高溫度，則TPC呈先增大后減小的趨勢。由于等高線圖趨近于橢圓且長軸與橫坐標(biāo)軸的順時針夾角為鈍角，同時其響應(yīng)面坡度較為陡峭，說明二者之間具有較強(qiáng)的拮抗作用。

由圖8的等高線圖可以看出，在液料比和超聲功率處于較低水平時，等高線比較平緩，2因素的變化對增大TPC的作用不明顯；而在較高水平時，TPC隨著2因素水平的提高呈先增大后減小的趨勢。此外，長軸與橫坐標(biāo)軸夾角與圖7相反則說明二者之間具有明顯的協(xié)同作用，這與回歸方程中X1X3的系數(shù)為正號相符合。

圖9傾斜趨勢與圖8相似，故可知液料比與超聲時間也具有相互促進(jìn)的交互作用。但圖9等高線圖中的橢圓長軸與橫坐標(biāo)軸的夾角更小且橢圓長短軸比例較低，故二者交互作用顯著性小于液料比與超聲功率。這與表4中PX1X4>PX1X3的結(jié)論一致。

圖7 液料比和提取溫度交互作用對總酚含量的影響Figure 7 Liquid of ratio to solid and extracting temperature on the impact of interaction on TPC

圖8 液料比和超聲功率交互作用對總酚含量的影響Figure 8 Liquid of ratio to solid and ultrasonic power on the impact of interaction on TPC

圖9 液料比和超聲時間交互作用對總酚含量的影響Figure 9 Liquid of ratio to solid and ultrasonic time on the impact of interaction on TPC

圖10是提取溫度與超聲時間的交互作用圖，其等高線與圖9相似且響應(yīng)曲面坡度更為陡峭，由此可得出這2個因素相互促進(jìn)，且交互作用最強(qiáng)。

圖11為提取溫度與超聲功率對TFC交互作用的響應(yīng)面及等高線圖，從圖11可看出，提取溫度較低時，TFC隨超聲功率的增大呈先增大后減小的趨勢，在較高的提取溫度水平條件下，隨超聲功率的增大，TFC呈先增大后減小的趨勢。在超聲功率所選范圍內(nèi)，TFC均隨著提取溫度的升高逐漸增大最后趨于平緩。按照上述方法進(jìn)行分析可知提取溫度與超聲功率具有協(xié)同作用。

從圖12上看，當(dāng)提取溫度處于較低水平時，TFC受超聲時間的改變影響較大，而當(dāng)提高提取溫度時，超聲時間的延長對TFC變化的影響降低，這說明二者之間具有相互抑制的作用，同時從橢圓長軸與橫坐標(biāo)軸的順時針夾角>90°也印證了此結(jié)論。

2.2.3 工藝優(yōu)化及驗證 為確定總酚和總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，對回歸模型進(jìn)行逐步回歸，然后求一階偏導(dǎo)，并令其為零，得到總酚提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比1∶16.14 (g/mL)、提取溫度55.97 ℃、超聲功率267.03 W、超聲時間54.24 min，預(yù)計TPC為4.44 mg/g；得到總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比1∶21.45 (g/mL)、提取溫度59.29 ℃、超聲功率247.28 W、超聲時間54.59 min，預(yù)計TFC為15.51 mg/g。為了考察預(yù)測結(jié)果的可靠性，應(yīng)在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行驗證實驗，但考慮到儀器功能的限制及操作簡便，故調(diào)整總酚提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比1∶15 (g/mL)、提取溫度55 ℃、超聲功率270 W、超聲時間55 min；調(diào)整總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度60 ℃、超聲功率240 W、超聲時間55 min。結(jié)果顯示TPC和TFC的測定值分別為(4.42±0.06)，(15.20±0.11) mg/g，通過方差分析表明，實測值與預(yù)測值差異不顯著(P<0.05)，故本研究所得模型可靠有效。

3 結(jié)論

本試驗采用四因素三水平響應(yīng)面分析法對荸薺皮總酚和總黃酮的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到總酚提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶15 (g/mL)，提取溫度55 ℃，超聲功率270 W，超聲時間55 min，此條件下總酚含量的最大響應(yīng)值為4.42 mg/g；得到總黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶20 (g/mL)，提取溫度60 ℃，超聲功率240 W，超聲時間55 min，此條件下總黃酮含量的最大響應(yīng)值為15.20 mg/g，與先前的研究[10]相比，總黃酮的提取率提高了21.6%，可能是本試驗把超聲功率作為影響因素進(jìn)行考察，而超聲功率是影響荸薺皮總黃酮超聲輔助提取的最主要因素。

圖10 提取溫度和超聲時間交互作用對總酚含量的影響Figure 10 Extracting temperature and ultrasonic time on the impact of interaction on TPC

圖11 提取溫度和超聲功率交互作用對總黃酮含量的影響Figure 11 Extracting temperature and ultrasonic power on the impact of interaction on TFC

圖12 提取溫度和超聲時間交互作用對總黃酮含量的影響Figure 12 Extracting temperature and ultrasonic time on the impact of interaction on TFC

本試驗是以廢棄荸薺皮為原料，旨在變廢為寶，為高效開發(fā)利用荸薺皮資源提供參考。但如何從實驗室放大到工業(yè)化應(yīng)用，如何在同等效率下有效降低成本將成為下一步研究的重點(diǎn)。