胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)氧化損傷精子的保護(hù)作用

劉文靜 李月梅 王 磊 張榮玲 高建軍

山東省濰坊市婦幼保健院 （濰坊 261011）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指化學(xué)性質(zhì)活潑、氧化能力很強(qiáng)的一類含氧物質(zhì)，主要包括H2O2、羥基（-OH）、活性氮類（NO）等。過(guò)量的ROS引起的氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致男性不育的重要病因[1]，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生過(guò)多的因素包括吸煙、生殖道感染、精索靜脈曲張、環(huán)境污染物以及實(shí)驗(yàn)室精液處理等。研究證實(shí)，過(guò)量ROS會(huì)導(dǎo)致精子膜、線粒體及核DNA受損，使精子運(yùn)動(dòng)功能改變，并導(dǎo)致受精能力下降[2,3]。因此尋找有效的抗氧化物質(zhì)，降低ROS造成的氧化損傷成為目前男性不育的研究熱點(diǎn)。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）具有促進(jìn)有絲分裂、抗細(xì)胞凋亡等胰島素樣生物學(xué)效應(yīng)，涉及生殖細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。許多報(bào)道顯示IGF-1具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡的作用[4,5]，但是IGF-1對(duì)精子氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的作用目前鮮有報(bào)道。本研究旨在觀察IGF-1對(duì)人精子體外氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的作用。

材料與方法

一、材料

收集2015年1月至5月來(lái)濰坊市婦幼保健院生殖健康科查體的健康且有生育力的男性精液28例（志愿者），按照第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[6]（以下簡(jiǎn)稱第5版《WHO》）進(jìn)行檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：液化時(shí)間在60min內(nèi)，精子濃度＞60×106/mL，精子前向運(yùn)動(dòng)率（PR）＞32%，精液體積＞1.5 mL，正常形態(tài)精子比率＞4%，白細(xì)胞濃度＜1×106/mL。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)本院倫理委員會(huì)審查，并與志愿者簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

IGF-1購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；Diff-Quik試劑盒購(gòu)自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；DNA碎片率檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳博銳德生物科技有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；精子培養(yǎng)液SpermRinse購(gòu)自瑞士vitrolife公司；計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）使用清華同方精子分析儀。

三、精子懸液制備

男方禁欲3～7 d，手淫法留取精液。待精液充分液化后采用直接上游法處理精液：取精液1.5mL加入試管底部，在其上方緩慢加入等體積的培養(yǎng)液SpermRinse，將試管傾斜45°。于37℃培養(yǎng)箱放置30 min, 輕輕吸取上層云霧狀液體，300×g，離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)液，將精子濃度調(diào)整為10×106/mL。

四、實(shí)驗(yàn)分組

每例精子懸液平均分成4份，實(shí)驗(yàn)分為4組。對(duì)照組：僅精子懸液；H2O2組：精子懸液+100μmol/L H2O2；25ng/mL IGF-1組：精子懸液+25ng/mL IGF-1+100μmol/L H2O2；50ng/mLIGF-1組：精子懸液+50ng/mL IGF-1+100μmol/L H2O2。各組樣本置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，分別于12 h、24 h后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

五、檢測(cè)指標(biāo)

（一）精子活力檢測(cè)

于培養(yǎng)后12 h及24 h，按照第5版《WHO》標(biāo)準(zhǔn)，采用CASA分析對(duì)各組精子進(jìn)行活力檢測(cè)，記錄各組精子活力、PR。

（二） 精子形態(tài)學(xué)分析

將各組精子懸液涂片，自然晾干后，采用Diff-Quik染色法進(jìn)行染色，按第5版《WHO》嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行判別，計(jì)數(shù)正常形態(tài)及畸形精子，記錄各組正常形態(tài)精子比率。

（三）精子DNA碎片率的檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書，采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法檢測(cè)精子DNA碎片率。（1）精液標(biāo)本處理：取出精子懸液60μL加入已熔化的易熔凝膠管中，充分混勻；加30μL精子凝膠混合液于預(yù)先處理的載玻片上，迅速蓋上蓋玻片, 置于2～8℃冰箱5 min，使其凝固。（2）變性處理：從冰箱中取出載玻片，小心移去蓋片。將載玻片浸入反應(yīng)液A內(nèi)，20～28℃反應(yīng)7 min, 然后于反應(yīng)液B內(nèi)20～28℃反應(yīng)25 min, 再將載玻片浸入大量的純化水中5 min；（3）脫水、干燥、染色：將載玻片依次放入70%、90%和100%乙醇中脫水各2 min。空氣中自然干燥后以瑞氏染液染色，室溫15min后用流水輕輕沖洗染片；（4）光學(xué)顯微鏡觀察：普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察500個(gè)精子，計(jì)數(shù)存在DNA碎片率的精子數(shù)量。

（四）MDA的檢測(cè)

采用硫巴比妥酸法（TBA）檢測(cè)精子脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，按試劑盒說(shuō)明書操作方法測(cè)定MDA含量，用分光光度計(jì)讀取吸光度值，根據(jù)精子濃度平衡后的MDA值以nmol/109精子表示。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組精子活力比較

在培養(yǎng)后12h及24h，與H2O2組比較，對(duì)照組活力及PR均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在培養(yǎng)后12h及24h 50ng/mL IGF-1組與H2O2組比較，活力和PR均有提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；另外，在培養(yǎng)后24 h，25ng/mL IGF-1組PR較H2O2組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

二、各組正常形態(tài)精子比率、DNA碎片率比較

在培養(yǎng)后12h及24h，各組間正常形態(tài)精子比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在培養(yǎng)后12h及24h，與H2O2組比較，對(duì)照組及50ng/mL IGF-1組DNA碎片率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；在培養(yǎng)后24 h，25ng/mL IGF-1組DNA碎片率較H2O2組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

三、 各組精子MDA水平比較

在培養(yǎng)后12 h及24 h，對(duì)照組MDA水平較H2O2組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；50ng/mL IGF-1組與H2O2組比較，50ng/mL IGF-1組MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。另外，培養(yǎng)后24 h，25ng/mL IGF-1組與H2O2組比較，25ng/mL IGF-1組MDA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表1 各組精子活力及PR比較（±s）

表1 各組精子活力及PR比較（±s）

與H2O2組比較，*P＜0.05，** P＜0.01

PR(%)12h 24h 12h 24h對(duì)照組 87.43±2.93** 73.47±5.89** 81.75±3.63** 59.53±5.58**H2O2組 80.27±4.87 59.28±6.57 70.63±5.19 45.51±7.78 25ng/mL IGF-1組 83.08±3.76 62.93±5.43 72.81±4.94 51.47±5.83*50ng/mL IGF-1組 86.35±2.42* 72.14±4.97** 76.57±4.43* 56.13±4.69**組別 活力(%)

表2 各組正常形態(tài)精子比率、DNA碎片率比較（±s）

表2 各組正常形態(tài)精子比率、DNA碎片率比較（±s）

與H2O2組比較，*P＜0.05， ** P＜0.01

組別 正常形態(tài)精子比率(%) DNA碎片率(%)12h 24h 12h 24h對(duì)照組 11.05±3.41 11.56±3.04 4.73±1.15* 8.26±1.72**H2O2組 10.68±2.64 10.56±2.48 6.14±1.38 13.63±2.05 25ng/mL IGF-1組 10.42±2.26 11.14±2.73 5.78±1.66 11.71±1.69*50ng/mL IGF-1組 10.86±3.29 10.67±2.50 5.27±1.43* 10.45±1.87**

表3 各組精子MDA水平比較（±s）

表3 各組精子MDA水平比較（±s）

與H2O2組比較，*P＜0.05， **P＜0.01

組別 MDA(nmol/109精子)12h 24h對(duì)照組 17.32±3.96* 24.83±4.66**H2O2組 24.97±6.53 37.16±6.74 25ng/mL IGF-1組 23.04±5.15 33.42±6.07*50ng/mL IGF-1組 20.57±4.91* 31.54±5.32*

討 論

越來(lái)越多的研究表明IGF-1對(duì)睪丸功能起著重要的調(diào)節(jié)作用，IGF-1通過(guò)旁分泌/自分泌調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育和功能。IGF-1缺陷可導(dǎo)致Leydig細(xì)胞體積和數(shù)量減少，睪酮水平下降及精子數(shù)量減少[7]。研究顯示IGF-1受體存在于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞及精子中，IGF-1可能對(duì)精子的產(chǎn)生、成熟及活力發(fā)揮著重要的作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1對(duì)低溫培養(yǎng)及冷凍保存的精子有保護(hù)作用[9,10]，因此IGF-1對(duì)精子氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的作用是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。

活性氧（ROS）能引起精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，并且損傷精子線粒體從而導(dǎo)致精子活動(dòng)力下降[11]。本研究顯示，在培養(yǎng)后12 h及24 h ，H2O2組的精子前向運(yùn)動(dòng)百分比及活力較對(duì)照組均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明ROS導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)能力下降。50ng/mL IGF-1組的精子活力及前向運(yùn)動(dòng)百分比較H2O2組均顯著上升（P＜0.05），提示適當(dāng)濃度的IGF-1能明顯降低ROS對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力的損傷。

本研究中，在培養(yǎng)后12 h及24 h ，各組間正常形態(tài)精子比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。精子在生成過(guò)程中經(jīng)過(guò)一系列的變化而形成了精子特定的形態(tài)，因此精子形態(tài)是經(jīng)過(guò)一定時(shí)間和復(fù)雜的變化而形成的，在短時(shí)間內(nèi)，ROS介導(dǎo)的過(guò)氧化反應(yīng)并未引起精子形態(tài)的明顯改變。但H2O2會(huì)造成精子超微結(jié)構(gòu)的哪些改變以及IGF-1對(duì)此結(jié)構(gòu)損傷是否有改善作用還需進(jìn)一步研究。

精子DNA完整性對(duì)精卵結(jié)合和胚胎發(fā)育具有重要意義，與輔助生殖技術(shù)也密切相關(guān)，DNA完整性的破壞可從精子濃度、活力及受精能力等各方面影響精子。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激是造成精子DNA損傷的主要原因，DNA堿基對(duì)氧化應(yīng)激敏感，活性氧自由基能與其反應(yīng)引起堿基修飾、DNA鏈斷裂以及染色質(zhì)交聯(lián)[12]。本研究采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)精子DNA碎片率，結(jié)果顯示，H2O2組精子DNA碎片率較對(duì)照組均明顯升高，25ng/mL IGF-1組在培養(yǎng)后24 h、50ng/mL IGF-1組在培養(yǎng)后12 h及24 h DNA碎片率較H2O2組均明顯下降，提示IGF-1能在一定程度上抑制ROS對(duì)精子DNA的損傷，保護(hù)精子DNA的完整性。

MDA是ROS攻擊精子細(xì)胞膜產(chǎn)生的主要脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA的水平可間接反映ROS對(duì)精子的損害程度。有報(bào)道IGF-1能夠提高超氧化物歧化酶（SOD）含量，降低MDA水平，具有一定的抗自由基的作用[4,5]。本研究結(jié)果顯示50ng/mL IGF-1組MDA水平明顯低于H2O2組，說(shuō)明IGF-1可以降低ROS引起的精子脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而保護(hù)精子的運(yùn)動(dòng)功能，降低精子的DNA損傷。

無(wú)論是精子活力還是DNA碎片率各組間比較，均顯示50ng/mL IGF-1組具有明顯的保護(hù)作用。本研究顯示，IGF-1對(duì)活性氧導(dǎo)致的精子運(yùn)動(dòng)功能下降及DNA損傷具有一定的保護(hù)作用，為IGF-1在男性不育中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。