金雀異黃素對血小板微顆粒誘導的類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞遷移和侵襲的影響

沈 芹，柳桂萍，王雯雯，胡 君，周 瑋，劉家歡，王 慧，沈維干，張 育,

(1. 揚州大學附屬蘇北人民醫院風濕免疫科，江蘇 揚州 225001；2. 泰州市人民醫院風濕免疫科，江蘇 泰州 225300；3. 江蘇省武警總隊醫院內科，江蘇 揚州 225001；4. 揚州大學附屬醫院血液風濕科，江蘇 揚州 225001；5. 揚州大學醫學院，江蘇 揚州 225001)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)作為多關節炎癥性疾病，其主要的病理改變包括關節滑膜炎及血管炎。關節滑膜細胞分為A型巨噬樣滑膜細胞和B型成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)。FLS位于滑膜襯里層，可向關節軟骨表面遷移和侵襲，導致關節軟骨及骨的侵蝕，最終引起關節破壞，在RA的發生、發展過程中發揮重要作用[1]。血小板微顆粒(platelet-derived microparticles，PMPs)是血小板活化過程中形成的囊性小泡[2]。我們的前期研究證實，PMPs能夠通過ERK/NF-κB通路及CXCR2/NF-κB通路，促進RA-FLS與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的黏附，提高其遷移和侵襲能力[3-4]，提示PMPs通過NF-κB信號通路，影響RA-FLS的遷移及侵襲，可能為RA骨侵蝕機制的研究提供了新視角。

金雀異黃素(genistein，Gen)是一種異黃酮類化合物，廣泛存在于豆類植物中，具有酪氨酸激酶抑制劑活性[5]。課題組前期研究證實，Gen可抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)等炎癥因子的分泌，以及膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠FLS的增殖，同時緩解CIA大鼠關節炎癥和關節的損害[6-8]。本實驗進一步觀察Gen對PMPs誘導的RA-FLS遷移和侵襲的影響，并探討其可能的機制，為RA治療的靶點選擇提供理論依據，并為臨床醫師的工作提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM高糖培養基(HyClone公司)；胎牛血清(FBS，Gibco公司)；Gen、羅丹明標記的鬼筆環肽(Sigma公司)；人纖維連接蛋白(fibronectin，瑞士羅氏公司)；Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、Matrigel(美國BD公司)；CCK-8(上海生博生物醫藥科技有限公司)；兔抗人NF-κB 、p-NF-κB、p-IκB及鼠抗人IκB單克隆抗體(CST公司)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz公司)。PMPs的制備和鑒定，按本課題組前期建立的方法進行[4]。二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；垂直電泳槽、電轉移槽(Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(日本NIKON公司)。

1.2細胞培養RA-FLS細胞株MH7A購自上海賽齊生物科技有限公司。使用含10% FBS的DMEM高糖培養基培養，置于37 ℃、5% CO2以及飽和濕度條件中，擇生長良好的3～6代細胞用于后續實驗。

1.3細胞活力檢測實驗空白組不做任何處理；PMPs組給予100 mg·L-1PMPs處理24 h；另外3組為PMPs+Gen組，在100 mg·L-1PMPs作用24 h后，給予20、40、60 μmol·L-1的Gen干預24 h。將各組細胞接種于96孔板，細胞數量約為每孔5×103個，設置6個復孔，37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，按CCK-8試劑盒說明操作，于酶標儀上測量波長450 nm處的OD值，實驗重復3次。設定空白組細胞活力為100%，其他各組相對細胞活力=實驗組細胞OD值/空白組細胞OD值×100%。

1.4Transwell細胞遷移與侵襲實驗

1.4.1遷移實驗 空白組細胞密度達90%時，使用無血清培養基饑餓12 h；PMPs組和PMPs+Gen組細胞先后使用含100 mg·L-1PMPs的完全培養基(10% FBS)和含100 mg·L-1PMPs的無血清培養基培養12 h。0.25%胰蛋白酶消化MH7A，室溫下1 200 r·min-1離心10 min收集；用低濃度血清培養基(2% FBS)重懸細胞，細胞計數后，制成5×108·L-1的細胞懸液，PMPs+Gen組細胞懸液加入不同濃度的Gen；將上述細胞懸液分別加至Transwell上室，每孔100 μL；在Transwell下室分別加入完全培養基500 μL，其中PMPs+Gen組Transwell下室加入不同濃度的Gen；放入小室培養24 h；取出小室，吸去上室液體，PBS清洗3次，用棉簽拭去上室細胞，將小室倒扣晾干；向下室加入快速吉姆薩染色試劑A液，固定2 min，取出小室，加入2倍體積的B液，混勻后染色8 min；PBS洗滌后，于100×倒置顯微鏡下，隨機選取8個視野拍攝，計算每個視野內的細胞數，結果用相對于空白組倍數的均值表示，實驗重復3次。

1.4.2侵襲實驗 按前述方法處理MH7A；取100 mg·L-1的Matrigel 稀釋液100 μL包被小室，37 ℃孵育過夜；吸凈殘液后，向小室中加入100 μL DMEM培養基，37℃孵育30 min，水化基底膜；其余步驟同遷移實驗。

1.5細胞與ECM黏附實驗

1.5.1細胞與Collagen Ⅰ、Fibronectin黏附實驗 按細胞活力檢測實驗方法處理細胞；分別取濃度為10 mg·L-1的Collagen Ⅰ、Fibronectin工作液100 μL置于96孔板中，4 ℃過夜；棄上清，加入1% BSA 100 μL，37 ℃封閉1 h；收集細胞，制備2.5×108·L-1的細胞懸液，每孔加入100 μL，設6個復孔，孵育30 min；去上清及PBS洗滌后，每孔加入100 μL無血清培養基和10 μL CCK-8試劑，孵育30 min；用酶標儀測定波長450 nm處的OD值，實驗重復3次。

1.5.2細胞與Matrigel黏附實驗 類似于“1.5.1”實驗，區別為鋪膠時，每孔加濃度為100 mg·L-1的Matrigel稀釋液50 μL，37 ℃孵育1 h。

1.6細胞免疫熒光染色收集細胞，接種于放有蓋玻片的24孔板中，細胞數量約為每孔5×104個，按細胞活力檢測實驗方法處理細胞；用免疫熒光固定液室溫固定30 min；再加入含0.5% Triton X-100的PBS，室溫透化細胞10 min；3% BSA室溫封閉1 h后，用羅丹明標記的鬼筆環肽染色細胞，室溫避光孵育2 h；再以0.5 mg·L-1DAPI室溫避光孵育樣本15 min；洗滌封片后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7Westernblot檢測按細胞活力檢測實驗處理MH7A后，收集各組細胞進行蛋白提取和濃度測定。按照Western blot常規步驟操作，用Image J軟件分析蛋白質免疫印跡圖像灰度值。

2 結果

2.1Gen對PMPs作用后RA-FLS的活力無明顯影響Fig 1的CCK-8檢測結果顯示，與空白組比較，PMPs作用后RA-FLS的活力稍有增強；然而，空白組、PMPs組和PMPs+Gen(20、40、60 μmol·L-1)組之間細胞活力比較差異無統計學意義(P>0.05)。

Fig 1 Effects of Gen on cell viability of RA-FLS after incubation with n=3)

2.2Gen抑制PMPs誘導的RA-FLS的遷移和侵襲Fig 2、3的Transwell遷移和侵襲實驗結果顯示：與空白組相比，PMPs組RA-FLS的遷移和侵襲能力明顯增強(P<0.05)；相對于PMPs組，PMPs+Gen組RA-FLS的遷移和侵襲能力均有所減弱，PMPs+20 μmol·L-1Gen組與PMPs組相比差異無統計學意義(P>0.05)，而PMPs+Gen(40、60 μmol·L-1)組與PMPs組相比差異有統計學意義(P<0.05)。上述結果提示，Gen可抑制PMPs誘導的RA-FLS的遷移和侵襲。

2.3Gen抑制PMPs作用后RA-FLS與ECM的黏附如Fig 4所示，PMPs組RA-FLS與3種不同ECM模擬物的黏附能力高于空白組(P<0.05)；而PMPs+Gen組RA-FLS與ECM的黏附能力均低于PMPs組，其中PMPs+ Gen(40、60 μmol·L-1)組與PMPs組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。結果

Fig 2 Effects of Gen on migration of RA-FLS induced by PMPs(×200)

提示，Gen可以抑制PMPs誘導的RA-FLS與ECM的黏附。

2.4Gen影響PMPs誘導的RA-FLS肌動蛋白細胞骨架的重排Fig 5的細胞免疫熒光染色結果顯示，與空白組相比，PMPs組RA-FLS的應力纖維明顯變細、變少，片狀偽足增多；與PMPs組相比，PMPs+Gen組RA-FLS的片狀偽足減少，應力纖維增粗。結果提示，PMPs可能通過改變肌動蛋白細胞骨架重塑，促進RA-FLS的遷移和侵襲，而Gen可通過影響RA-FLS的肌動蛋白細胞骨架裝配，達到抑制PMPs誘導的RA-FLS遷移和侵襲的作用。

Fig 3 Effects of Gen on invasion of RA-FLS induced by PMPs (×200)

2.5Gen對PMPs激活的RA-FLS中NF-κB通路的影響Fig 6的Western blot結果顯示，與空白組相比，PMPs可上調RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表達；與PMPs組相比，PMPs +Gen組RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表達下調。提示Gen可抑制PMPs激活的NF-κB信號通路，從而進一步抑制RA-FLS的遷移和侵襲。

3 討論

RA的病理特征包括關節滑膜炎及滑膜襯里層增生，FLS的增殖和向關節軟骨表面遷移和侵襲在RA病程的演變、炎癥的維持以及軟骨與骨的破壞等過程中，都發揮了重要作用[1,9-10]。

Fig 4 Effects of Gen on adhesion to ECM of

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPMPs group

Fig5EffectsofGenonactincytoskeletonrearrangementofRA-FLSinducedbyPMPs(×1000)

A: Control group; b: PMPs group; c: PMPs+20 μmol·L-1Gen group; d: PMPs+40 μmol·L-1Gen group; e: PMPs+60 μmol·L-1Gen group.

本課題組為明確Gen對PMPs誘導的RA-FLS遷移和侵襲的作用，首先采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞的活力，發現PMPs +Gen組細胞活力相較于空白組和PMPs組，差異均無統計學意義，排除了Gen對細胞活力的影響導致的遷移和侵襲能力改變的可能性。然后，本研究通過Transwell細胞遷移和侵襲實驗，觀察Gen對PMPs誘導的RA-FLS遷移和侵襲的影響。結果表明，PMPs組RA-FLS的遷移和侵襲能力高于空白組，而PMPs +Gen組RA-FLS遷移和侵襲的能力較PMPs組有所減弱。上述結果提示，在PMPs作用的基礎上，Gen能夠抑制PMPs誘導的RA-FLS的遷移和侵襲。在細胞遷移和侵襲的

Fig 6 Effects of Gen on NF-κB pathway of RA-FLS activated by PMPs n=3)

1: Control group; 2: 20 μmol·L-1Gen group; 3: 40 μmol·L-1Gen group; 4: 60 μmol·L-1Gen group; 5: PMPs group; 6: PMPs+20 μmol·L-1Gen group; 7: PMPs+40 μmol·L-1Gen group; 8: PMPs+60 μmol·L-1Gen group.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPMPs group.

過程中，由于細胞必須先從黏附的ECM上脫落，然后再于新部位的黏附，因此，細胞與ECM黏附的改變是細胞發生遷移和侵襲的前提[11-12]。我們分別以CollagenⅠ、Fibronectin和Matrigel 作為ECM模擬物，觀察Gen對PMPs作用后RA-FLS與ECM 黏附的影響。結果表明，PMPs可促進RA-FLS與3種不同ECM的黏附，加入Gen后，PMPs誘導的RA-FLS與ECM類似物的黏附能力均下降， 提示Gen可以抑制PMPs誘導的RA-FLS與ECM的黏附。

有研究表明，Gen可通過重構細胞中肌動蛋白細胞骨架，減少偽足的形成，抑制腫瘤細胞與ECM的黏附、遷移和侵襲[12-13]。我們采用羅丹明標記的鬼筆環肽對RA-FLS的纖維狀肌動蛋白(filament actin, F-actin)骨架系統進行免疫熒光染色，觀察PMPs和Gen對RA-FLS的肌動蛋白細胞骨架裝配的影響。結果顯示，PMPs作用于RA-FLS后，RA-FLS的應力纖維明顯變細、變少，片狀偽足增多，提示PMPs可能通過改變肌動蛋白細胞骨架的重塑，促進RA-FLS的遷移和侵襲。在PMPs作用的基礎上加入Gen后，RA-FLS的應力纖維增粗，片狀偽足減少，提示Gen可通過影響RA-FLS的肌動蛋白細胞骨架裝配，達到抑制PMPs誘導的RA-FLS遷移和侵襲的作用。

NF-κB作為重要的核轉錄因子，與細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲密切相關，而NF-κB通路的活化能夠提高腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[14-15]。本課題組前期工作已證實，PMPs可通過活化NF-κB通路，促進RA-FLS的遷移和侵襲[3-4]。為進一步觀察Gen對PMPs激活的RA-FLS中NF-κB通路的影響，本研究采用Western blot檢測NF-κB信號通路組分蛋白的表達。結果顯示，與對照組相比，PMPs可上調RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表達，而對IκB、NF-κB無明顯影響；與PMPs組相比，PMPs +Gen組RA-FLS中IκB和NF-κB的磷酸化受到抑制，提示Gen可抑制PMPs激活的NF-κB信號通路，從而進一步抑制RA-FLS的遷移和侵襲。

綜上所述，Gen可通過抑制PMPs激活的NF-κB信號通路，影響RA-FLS的肌動蛋白細胞骨架裝配，從而抑制PMPs誘導的RA-FLS與ECM的黏附、遷移和侵襲。本研究揭示了Gen在PMPs誘導的RA-FLS遷移和侵襲過程中的作用及其機制，為尋找RA的藥物靶點和機制研究提供了方向。