18F-FLT micro PET/CT顯像評估馬藺子素對裸鼠乳腺癌的放射增敏作用

譙 鳳，徐慧琴，汪 會，余文靜，張 丹，蘇曉雨

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，安徽 合肥 230022)

惡性腫瘤嚴重著威脅人類健康，如何提高腫瘤治療效果及生存預后，是近幾十年來國內外研究熱點。對于中晚期惡性腫瘤，放射治療是主要治療方法之一，然而，實體瘤中乏氧組織的存在，嚴重影響放射治療效果。研究表明，腫瘤放療增敏劑是解決腫瘤內乏氧細胞對治療抗拒性的有效途徑之一[1]。我國自主研發(fā)的放射增敏劑馬藺子素(irisquinone，IR)是從中草藥馬藺子中提取的一種醌類化合物，對放射治療有明顯的增敏作用[2]。PET/CT能夠監(jiān)測腫瘤內環(huán)境，通過不同顯像劑更加全面準確地評價腫瘤治療反應。隨著核醫(yī)學顯像設備的發(fā)展，micro PET/CT能夠無創(chuàng)、動態(tài)、定量地從分子水平觀察藥物在小動物體內的吸收、分布、代謝、排泄等過程。3’-脫氧-3’-18F-氟胸苷(3’-deoxy-3’-18F-fluorothymidine,18F-FLT)作為新近開發(fā)的增殖顯像劑，可反映腫瘤增殖狀況，評價腫瘤放、化療療效[3]。本實驗擬通過建立裸鼠MDA-MB231乳腺癌模型，并對其用IR進行放射增敏治療，探討18F-FLT micro PET/CT顯像評估放射增敏療效的價值。

1 材料與方法

1.1細胞株與試劑MDA-MB231乳腺癌細胞株購自中科院上海細胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶，均購自美國Gibco公司；IR(批號：1601255)購自山東新華制藥公司；Ki-67抗體購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2實驗動物32只BALB/c裸鼠，♀，4～6周齡，體質量(20±2)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬2012-0002)。

1.3細胞培養(yǎng)及腫瘤接種MDA-MB231乳腺癌細胞采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，日本SANYO公司)中培養(yǎng)，待細胞貼滿瓶底約80%時，用含EDTA的胰酶消化制成單細胞懸液(2×1010·L-1)，取0.2 mL皮下接種于裸鼠右上肢腋下，待瘤體最大直徑≥1 cm時進行動物實驗。

1.4實驗動物分組皮下接種成瘤率100%，將制備成功的32只裸鼠乳腺癌模型隨機分為對照組、IR組、單純放療組、IR+放療組，每組8只。IR組：放療前7 d開始每日給予IR蒸餾水懸濁液灌服，劑量約為每只0.5 mg；對照組：給予蒸餾水灌服；單純放療組：每只裸鼠用0.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，放療采用美國Varian23EX醫(yī)用直線加速器，使用6 MeV電子線照射，單次放療，照射野10 cm×10 cm，劑量為10 Gy；IR+放療組：IR的灌服同IR組，放療方法及劑量同單純放療組。

1.518F-FLTmicroPET/CT顯像采用德國Siemens公司Inveon micro PET/CT進行掃描顯像；FLT前體購自常熟華益化工有限公司，18F-FLT由上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院PET中心生產(chǎn)，放化純>95%。所有MDA-MB231乳腺癌裸鼠模型均于放療前及放療結束后24 h，行micro PET/CT顯像。裸鼠于顯像前夜禁食，可自由飲水。將裸鼠固定，于裸鼠尾靜脈注射18F-FLT約5.55 MBq(150 μCi)，1 h后，用異氟烷麻醉并俯臥位固定于掃描床上進行顯像，CT掃描10 min，PET掃描5 min，然后圖像融合。顯像完成后，由2位高年資的核醫(yī)學科醫(yī)師對micro PET/CT圖像進行分析，選擇病灶放射性濃聚最高的層面，測量SUV最大值(SUVmax)。

1.6免疫組化檢測顯像完成后，采取頸椎脫臼法處死裸鼠。取出腫瘤組織，用體積分數(shù)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，行Ki-67免疫組化檢查。Ki-67蛋白以細胞核呈棕黃色或細胞質同時呈棕黃色為陽性。在高倍鏡下，隨機選擇5個視野拍照分析，計算每張照片陽性細胞所占百分比(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))。

2 結果

2.118F-FLTmicroPET顯像結果 32只裸鼠micro PET/CT顯像右側腋下均可見結節(jié)狀不同程度放射性攝取增高灶，部分腫瘤內部可見片狀放射性分布缺損區(qū)。放療前，4組顯像SUVmax比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.017，P>0.05)；放療后，4組之間SUVmax差異有統(tǒng)計學意義(F=123.145，P<0.05)，對照組及IR組顯像SUVmax較放療前明顯升高(t=-11.339、-11.103，P<0.05)，單純放療組及IR+放療組SUVmax較放療前明顯降低(t=13.516、22.753，P<0.05)，且IR+放療組SUVmax較單純放療組下降更明顯(t=7.065，P<0.05)。見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 The SUVmax of tumor in all groups before and

*P<0.05vsbefore radiotherapy;#P<0.05vs24h after radiotherapy

Fig 1 18F-FLT micro PET/CT imaging of MDA-MB231 breast cancer in nude mice 24 h after radiotherapy

A: Control group; B: IR group; C: Radiotherapy group; D: IR+radiotherapy group. The red arrowhead refers to the tumor.

2.2免疫組化結果如Fig 2所示，對照組、IR組、單純放療組、IR+放療組陽性細胞百分比分別為(46.43±3.69)%、(45.76±5.75)%、(28.13±4.74)%、(13.04±2.76)%，單純放療組及IR+放療組陽性細胞百分比明顯低于對照組(P<0.05)，IR+放療組較單純放療組陽性細胞百分比更低(P<0.05)。

Fig 2 The Ki-67 immunohistochemistry in all groups of MDA-MB231 breast cancer in nude mice(×400)

A: Control group; B: IR group; C: Radiotherapy group; D: IR+radiotherapy group; E: The percentage of Ki-67 positive cells.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsradiotherapy group.

2.3SUVmax與Ki-67表達的相關性分析Fig 3的Pearson相關分析結果顯示，Ki-67表達與SUVmax呈明顯正相關(r=0.897，P<0.05)。

Fig 3 Correlation between expression of Ki-67 and SUVmax

3 討論

腫瘤的早期療效評價直接影響腫瘤的后續(xù)治療，關系著患者的生存及預后，應用合適的療效評估方法可以給臨床提供很大的幫助。相比傳統(tǒng)的CT、MRI檢查，正電子發(fā)射型計算機體層成像(PET/CT)對于腫瘤的診斷、分期及療效評估有著獨特的優(yōu)勢[4]。那些通過對實體瘤大小變化來判斷治療效果的傳統(tǒng)方法，難以對腫瘤早期療效進行準確評估，而PET/CT顯像結合了PET功能成像與CT解剖成像的各自優(yōu)點，既能準確定位，又能在實體瘤大小變化之前，更早、更準確地從功能上評估腫瘤的放療增敏療效[5-6]。惡性腫瘤的一大生物學特點是生長快，腫瘤細胞增殖迅速，因此，可通過檢測腫瘤細胞增殖活性，評價腫瘤治療效果[7]。18F-FLT是一種胸腺嘧啶類似物，為新近開發(fā)的細胞增殖顯像劑，能夠在胸腺嘧啶核苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)的作用下磷酸化，生成FLT-磷酸鹽，滯留在細胞內。TK1是細胞DNA補救合成過程中的關鍵酶，在增殖細胞的S期和G1期有活性，而在靜止細胞中無活性，因此，18F-FLT可以間接反映腫瘤增殖狀況，評價腫瘤放、化療療效[8]。放射治療通過電離輻射破壞腫瘤細胞DNA，使細胞壞死達到治療目的，腫瘤對射線的敏感性是放射治療是否有效的關鍵[9]。大多數(shù)實體瘤中存在的乏氧細胞使得其對射線不敏感，對于這種情況，使用放射增敏劑可以抑制腫瘤內乏氧細胞對射線的抗拒作用，提高放射敏感性，從而增加治療效果[1]。IR是我國自主研發(fā)的一種放射增敏劑，它通過增加乏氧細胞DNA單鍵斷裂，抑制惡性腫瘤細胞DNA合成及斷裂后的修復，增加對放射治療的敏感性[2]。Ki-67是一種細胞核增殖抗原，表達于細胞周期的S、G1、G2、M期, 而在G0期不表達[10]。Ki-67的表達與細胞增殖活性及預后密切相關，Ki-67表達高預示著細胞增殖活性高，因此，其可反映細胞增殖狀態(tài)，同時Ki-67也可作為一種評估腫瘤治療及預后判斷的指標[11-12]。

本實驗對乳腺癌實體瘤行放射治療，使用放射增敏劑IR，并用18F-FLT micro PET/CT顯像評估放射治療療效。結果顯示，單純放療組及IR+放療組SUVmax均較放療前明顯下降，說明在放射治療后，腫瘤細胞DNA被破壞，腫瘤增殖受到抑制，滯留在細胞內的18F-FLT減少，因此，在micro PET/CT顯像中，腫瘤病灶的放射性攝取下降。IR+放療組較單純放療組SUVmax下降更明顯，表明使用IR增加了對乳腺癌放射治療的效果。免疫組化結果顯示，單純放療組與IR+放療組Ki-67的表達明顯低于對照組，IR+放療組表達更低，說明放射治療后，腫瘤細胞的增殖活性降低，而使用放射增敏劑的IR+放療組對放射治療更敏感。18F-FLT micro PET/CT顯像SUVmax與Ki-67表達呈正相關，進一步驗證了18F-FLT micro PET/CT顯像能反映腫瘤治療早期細胞增殖活性的變化。

綜上所述，IR對裸鼠乳腺癌具有放射增敏作用，18F-FLT micro PET/CT顯像可以通過反映腫瘤細胞增殖活性的變化，評估IR對乳腺癌的放射增敏作用。