香芹酚對STZ誘導的1型糖尿病小鼠主動脈血管重構的影響

劉 蕓，馬凱婷，袁曉悅，侯 寧

(廣州醫科大學1. 藥學院藥理學教研室、2. 基礎醫學實驗教學中心機能實驗室，廣東 廣州 511436)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由于免疫功能紊亂、微生物感染、遺傳因素等各種致病因子作用于機體，導致胰島素功能減退或胰島素抵抗而引起的糖、蛋白質、脂肪等一系列的代謝紊亂綜合征，臨床上主要以慢性血糖升高為主要特點。DM分為兩種類型，1型DM也叫胰島素依賴型，是由于胰島B細胞被破壞，導致胰島素絕對缺乏。2型DM也叫非胰島素依賴型，由于胰島素功能受損，導致胰島素相對缺乏。DM已經成為全世界發病率、死亡率最高的5種疾病之一。中國是DM大國，據統計，我國18歲及以上的成年人中DM患者已經超過1億，DM血管病變是DM患者主要的慢性并發癥，也是導致DM患者死亡的主要原因[1]。常見的血管病變分為大血管病變和微血管病變。大血管病變有心血管病變和腦血管病變，容易導致冠心病和腦卒中。微血管病變主要發生在腎臟、視網膜及皮膚的微血管，容易造成糖尿病性腎病，糖尿病性視網膜病變以及皮膚缺血性潰瘍。DM血管病變主要歸因于內皮細胞以及平滑肌細胞結構和功能障礙。因此，深入研究并闡明內皮細胞和平滑肌細胞功能受損參與DM血管并發癥的分子機制，并在此基礎上尋找干預靶點，對防治DM及其血管并發癥具有重要意義。

香芹酚(carvacrol，CAR)普遍存在于許多芳香植物的揮發油中，如牛至、百香果、冬季香薄荷、亞加菌等。CAR具有分子小、脂溶性高、易通過細胞膜等特點，同時對人體無毒，因而在日常生活中得到了廣泛應用，經常作為香料添加劑在食品中使用。目前的研究證實，CAR具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗菌[5]等生物活性。進一步的研究報道，CAR能促進大鼠離體胸主動脈內皮依賴性的血管舒張[6]。Suntres等[7]報道，在腦動脈分離的內皮細胞中，CAR通過激活TRPV3通道，使內皮細胞和平滑肌細胞發生超極化，導致血管舒張。以上研究提示CAR具有血管保護作用，但CAR對1型DM小鼠主動脈血管重構的影響目前尚不清楚。因此，本研究以C57BL/6小鼠為主要研究對象，通過腹腔注射鏈脲霉素(streptozocin，STZ)建立1型DM模型，探討CAR對DM小鼠主動脈血管重構的影響。

1 材料

1.1藥物與試劑CAR購自美國Aldrich公司；STZ購自美國Sigma公司；p-Akt、Akt、p-PDK1、PDK1、α-actin、Ki67抗體，均購自美國Cell Signal Technology公司。

1.2實驗動物SPF級C57BL/6小鼠，7～8周齡，♂，體質量(22.0±3.0)g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證：SCK(粵)2013-0002。飼養環境模擬自然晝夜條件，濕度45%～50%，溫度(22±3)℃，自由飲水。

1.3儀器低溫高速離心機(美國Eppendorf公司)；穩豪型血糖儀及血糖試紙(美國強生公司)；多功能酶標儀(美國Beckman公司)；自動洗片機(美國Kodak公司)。

2 方法

2.1DM模型的制備與分組DM模型組小鼠腹腔注射0.2% STZ(45 mg·kg-1·d-1)，連續注射5 d。對照組給予相應劑量的檸檬酸緩沖液。注射結束后3 d，檢測小鼠血糖，將血糖濃度高于16.7 mmol·L-1的小鼠視為DM模型誘導成功。DM模型誘導成功后第4周，檢測小鼠血糖持續、穩定升高，進行以下實驗分組：① 對照組(Con)；② DM組；③ CAR低劑量組(DM+CAR 10 mg·kg-1)；④ CAR高劑量組(DM+CAR 20 mg·kg-1)。每天腹腔注射CAR 1次，連續給藥6周。每周測量小鼠體質量和隨機血糖。給藥6周后處死小鼠，取出胸主動脈。

2.2HE染色主動脈固定在4%的多聚甲醛中，48 h內進行石蠟包埋，用蘇木精和伊紅染色，然后在光學顯微鏡下分析。

2.3Westernblot檢測主動脈裂解后，離心后取上清，BCA法蛋白定量，并制成蛋白樣品。經SDS-PAGE分離蛋白，電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫振蕩封閉1 h。用BSA/TBS稀釋的一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌5 min，反復3次，二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min，反復3次。加入 ECL 顯色液，暗室內X線片曝光。Image J軟件分析條帶。

2.4免疫組化檢測石蠟切片脫蠟至水，然后進行抗原修復，接著用3% BSA封閉30 min，在切片上滴加一抗4℃孵育過夜，d 2滴加二抗，然后用DAB顯色，復染細胞核，脫水封片，顯微鏡拍照采集圖像。

3 結果

3.1CAR對1型DM小鼠隨機血糖的影響如Fig 1所示，與正常小鼠相比，DM小鼠的隨機血糖明顯升高；與DM小鼠相比，CAR給藥組小鼠的隨機血糖降低(P<0.05)，且CAR低劑量組小鼠的隨機血糖與高劑量組相比，差異無統計學意義。說明CAR可以明顯降低1型DM小鼠的血糖。

Fig 1 Changes of mice random blood glucose during

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDM

3.2CAR對1型DM小鼠主動脈血管形態的影響Fig 2的HE結果顯示，DM組與正常組相比，主動脈血管壁變薄，細胞數量減少。低、高劑量CAR組可明顯改善DM小鼠主動脈血管重構，增加血管壁厚度。說明CAR可以明顯改善DM小鼠主動脈血管重構。

Fig 2 Morphological characteristics of aorta by HE staining

3.3CAR對1型DM小鼠主動脈血管平滑肌細胞表型的影響為了研究CAR改善血管重構的機制，分別用Western blot和免疫組化檢測了主動脈α-actin和Ki67的表達。Fig 3A的Western blot結果顯示，與對照組相比，DM組α-actin表達明顯增加(P<0.05)，低、高劑量CAR組可抑制DM誘導的α-actin表達增加(P<0.05)。Fig 3B的免疫組化結果顯示，DM組相比對照組Ki67表達降低(P<0.05)，而低、高劑量CAR組可明顯逆轉DM誘導的Ki67表達降低(P<0.05)。

3.4CAR對PDK1、Akt蛋白表達水平的影響為了研究CAR是否通過PI3K/Akt通路，改善主動脈血管重構，我們檢測了PDK1和Akt的表達水平。Fig 4的Western blot結果顯示，與對照組相比，DM組主動脈PDK1和Akt的磷酸化水平明顯降低(P<0.05)，低、高劑量CAR組可明顯抑制DM誘導的PDK1和Akt磷酸化水平的降低(P<0.05)。

4 討論

DM是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，心血管疾病是DM的重要并發癥，每年DM患者死于心血管疾病的比例占總死亡人數的50%～80%[8]。因此，DM誘發的心血管疾病是導致DM患者死亡的主要原因，研究DM心血管病變的分子機制具有十分重要的意義。

CAR又名香荊芥酚，具有麝香草酚類的氣味，存在于各類天然植物、果實及植物揮發油中，是牛至屬植物油的主要成分。在日常生活中，CAR常用于配制消毒劑、殺菌劑、香料、食品添加劑及防腐劑等。近年來，CAR在DM及其并發癥中的作用得到了研究者們的日益關注。有研究發現，在DM早期口服CAR可以輕度降低DM大鼠血糖，明顯降低總膽固醇、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸轉氨酶和乳酸脫氫酶[9]。Deng等[10]發現，CAR通過抗氧化、抑制炎癥等效應，改善DM大鼠認知功能障礙，對神經系統具有保護作用。項目組前期研究通過腹腔注射STZ建立1型DM小鼠模型，連續6周給予小鼠CAR(10、20 mg·kg-1)腹腔注射，發現CAR長期使用具有良好的降血糖效果。此外，CAR還可以輕度降低DM小鼠甘油三酯水平，改善DM小鼠脂質代謝紊亂[11]。但CAR對DM誘發的心血管并發癥是否具有保護作用，及其機制目前尚不清楚，亟待深入研究。因此，在前期研究基礎上，本課題通過腹腔注射低、高劑量CAR，檢測DM小鼠的主動脈血管形態及功能，評價CAR對1型DM小鼠血管重構的影響，并初步探討其機制。

Fig 3 Effects of CAR on expression of α-actin and Ki67 in aorta by Western blot

Fig 4 Effects of CAR on phosphorylation of PDK1 and Akt in aorta by Western blot n=5)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsDM

本研究結果發現，長期連續給予1型DM小鼠CAR(10、20 mg·kg-1)，其隨機血糖明顯降低，高劑量與低劑量組相比，差異無統計學意義。HE結果顯示，DM組主動脈血管壁變薄，細胞丟失。給予低、高劑量的CAR后，DM小鼠主動脈血管壁厚度都基本恢復至正常水平。DM血管病變可主要歸因于內皮細胞和平滑肌細胞結構和功能失調。其中，血管平滑肌細胞主要分布于動脈中膜，生理狀態下表現為收縮型，用于維持動脈收縮和舒張功能。在一些病理因素刺激下，細胞因子以自分泌或旁分泌的方式，促進血管平滑肌表型由收縮型轉變為合成型，從而促進血管平滑肌的增殖。研究表明，高糖通過激活Rho/蛋白激酶C通路，促進肌動蛋白聚合，誘導血管平滑肌細胞收縮功能增加[12]。Schmidt等[13]也證明，在1型DM模型中，Toll樣受體2通過激活RhoA通路，促進血管平滑肌收縮型標志基因肌球蛋白輕鏈、肌球蛋白磷酸酶亞單位Ⅰ的表達，從而增強血管的收縮功能。因此，在本實驗中，我們檢測了收縮型標志基因α-actin和合成型標志基因Ki67的表達。結果顯示，DM組α-actin表達增加，Ki67表達降低，低、高劑量CAR明顯降低DM組α-actin的表達，增加Ki67的表達。說明CAR能通過改變平滑肌細胞表型，改善1型DM持續高糖誘導的血管重構。

PI3K/Akt通路在細胞代謝、細胞周期調控、細胞凋亡、胰島素抵抗等生物學過程中發揮重要作用[14]。PDK1、Akt作為該通路的兩個關鍵激酶，其磷酸化狀態代表該通路的活化狀態。Hamamdzic等[15]的研究表明，在DM聯合高脂飲食誘導的豬模型中，Akt及其下游糖原合成酶激酶-3β的磷酸化被明顯抑制，導致細胞增殖與凋亡失衡，從而加劇動脈粥樣硬化。我們的研究結果與前期文獻報道一致，本實驗結果顯示，DM組PDK1及Akt的磷酸化水平受到抑制，給予低、高劑量的CAR后，Akt的磷酸化水平有所恢復，且PDK1的磷酸化水平基本恢復正常。說明CAR可能通過調節PI3K/Akt通路，抑制血管平滑肌的收縮功能，改善DM血管重構。

綜上所述，本實驗發現CAR可降低1型DM小鼠血糖，改善主動脈血管重構，對DM及并發的血管疾病有一定的治療作用。今后的工作中，我們將進一步在細胞水平明確CAR對血管重構的影響及其分子機制，為確定DM并發的血管疾病治療的新靶點提供初步的實驗依據。