葛黃顆粒對酒精性肝損傷大鼠醇、醛脫氫酶及細胞色素P450 2E1活性的影響*

楊國川，劉友平，李志，李波，梁楊，蒲清榮，魏嵋

（西南醫科大學 1.附屬中醫醫院 肝膽病科，2.基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，3.附屬中醫醫院 脾胃病科，四川 瀘州 646699）

酒精性肝損傷（alcoholic liver injury, ALI）是指長期大量飲酒所致的肝臟一系列病變，如酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化等[1]。肝臟是乙醇代謝的主要場所，機體攝入的乙醇90%在肝臟內代謝。大量研究證實乙醇在肝內主要有2條代謝途徑[1]：①醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase, ADH）氧化體系；②微粒體乙醇氧化酶體系（microsomal ethanol oxidizing system, MEOS）。當機體攝入少量乙醇時，乙醇主要通過第一條代謝途徑進行代謝，即乙醇在肝內首先由ADH氧化為乙醛，繼而被醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）氧化為乙酸最終分解為CO2和H2O。但當長期大量飲酒時，血液中高濃度的乙醇會激活第2條途徑MEOS，刺激該系統的細胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP450 2E1）活性增加參與乙醇的分解代謝，該途徑在乙醇代謝過程中會產生大量的活性氧及毒素乙醛，對肝臟導致極大的損傷[2]。由此可見，ADH、ALDH及CYP450 2E1是肝臟中參與乙醇代謝的最主要酶分子，也是導致酒精性肝損傷的主要機制所在[3]。

針對以上乙醇的代謝特點，當前解酒藥的開發主要從以下兩方面進行：①加強乙醇在胃腸道的首過代謝，抑制其胃腸吸收以降低血中乙醇的濃度；②藥物直接作用于參與乙醇代謝的酶系，提高乙醇及其代謝產物的消除率以減輕其對肝臟及其他組織的損傷[4]。葛黃顆粒是本院全國中西醫結合肝病專家孫同郊教授經過長期臨床探索總結出的純中藥解酒經驗方，具有保肝、降酶、降脂的功效，對長期大量飲酒造成的醉酒及預防酒精性肝損傷收到良好的效果。本研究探討葛黃顆粒對酒精性肝損傷模型大鼠ADH、ALDH及CYP450 2E1的影響，以進一步了解葛黃顆粒的解酒機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠共90只，體重150～200 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物

葛黃顆粒由西南醫科大學附屬中醫醫院中藥制劑室自制的院內顆粒劑組方。處方組成：葛花、趕黃草、柴胡、丹參、枳棋子、虎杖、白術、甘草等。批號20160405，規格10 g/袋。

1.3 試劑

紅星二鍋頭酒由北京紅星股份有限公司生產，批號20151001，規格53% Vol，750 ml/瓶；普通飼料（西南醫科大學實驗動物中心），油紅O染液購自北京索萊寶科技有限公司，丙氨酸氨基轉移酶（alartine arninotransferase, ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase, AST）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，ADH、ALDH檢測試劑盒購自上海橋杜生物科技有限公司，Anti-Cytochrome P4502 E1抗體購自Abcam公司。

1.4 方法

90只SD雄性大鼠適應性喂養1周后隨機分為5組：即正常對照組（正常組）、模型組，葛黃顆粒干預的高、中、低劑量組（簡稱高劑量組、中劑量組及低劑量組），正常組10只，其余各組20只。模型組、干預組均給予紅星二鍋頭灌胃（乙醇濃度由30%開始，每2周遞增乙醇濃度5%，直至乙醇濃度為53%維持3周），劑量為2.0 ml/（100 g·d）（分上下午2次，每次1.0 ml/100 g），正常組采用蒸餾水灌胃2.0 ml/（100 g·d），方法同上。以上各組均自由飲水，飼普通飼料，每周稱取體重1次。實驗7周后，隨機從模型組中選出2只大鼠，取肝臟行HE染色觀察其病理學改變，判定已形成ALI，開始給藥干預處理，高、中、低劑量組分別灌胃葛黃顆粒0.75、0.50和0.25 g/（100 g·d）（以上藥物劑量是根據臨床計量的換算及前期預試實驗所定），灌胃體積1.0 ml/（100 g·d）（每天上午給藥），持續給藥至13周結束。

干預組最后1次給藥后禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉0.3～0.4 ml/100 g麻醉，采集腹主動脈血，高速離心10 min后取血清，置入-80℃冰箱冷凍保存備用。全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST等肝功能指標，ELISA檢測ADH、ALDH含量；然后各組大鼠剖腹快速取出肝臟，稱量肝濕重，計算肝臟指數（肝臟指數=完整肝臟濕重/體重×100%）；切取相同肝葉并用4%甲醛固定，行HE染色觀察肝組織的結構；剩余肝組織采用Western blot檢測CYP450 2E1表達量。Western blot基本過程：一抗為1∶1 000鼠來源抗P450 2E1蛋白4℃孵育過夜，二抗為1∶3 000羊抗鼠HRP搖床上低速震蕩1 h，曝光顯影結果采用Bandscan圖像分析軟件進行光密度積分值分析。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，先用Komogorov-Smimov法進行正態分布檢驗，用Leneve法進行方差齊性檢驗，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織HE染色情況

正常組大鼠肝細胞形態正常無腫大，結構無紊亂，細胞排列規整。模型組肝細胞腫大明顯，結構不清晰，邊界不清，細胞排列層次紊亂，肝細胞內可見大小不一的脂肪空泡，少數細胞核被脂肪空泡擠到一邊。高劑量組大鼠肝細胞組織形態及結構較模型組改善明顯，肝細胞排列較整齊，僅少數肝細胞出現大小不一，呈輕度腫大。中劑量組肝細胞結構、組織形態與模型組相比有所改善，但肝細胞仍存在腫大。低劑量組與模型組比較，組織形態及結構無明顯改變，肝細胞仍腫大明顯，細胞排列無規則，肝細胞內可見脂肪空泡。見圖1。

2.2 各組大鼠肝臟指數的比較

模型組，低、中劑量組肝臟指數較正常組升高（均P＜0.05）；高、中劑量組肝臟指數與模型組比較均降低（P＜0.05），且存在低劑量組＞中劑量組＞高劑量組的規律。高、中、低劑量組組間比較均無差異。見表1。

圖1 各組大鼠病理切片 （HE×400）

表1 各組大鼠肝臟指數的比較 （±s）

表1 各組大鼠肝臟指數的比較 （±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 肝臟指數正常組 2.078±0.316模型組 3.168±0.3021）高劑量組 2.320±0.2582）中劑量組 2.524±0.1091）2）低劑量組 2.675±0.1961）F值 2.578 P值 0.014

2.3 各組大鼠血清AST、ALT、ALDH、ADH含量比較

各組大鼠血清AST、ALT、ALDH、ADH含量比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其余各組血清AST、ALT及ADH均有所升高，除高劑量組升高無差異外，其余各組升高差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，AST、ALT、ALDH在低、中、高劑量組均有所下降，下降趨勢依次遞減，但僅葛黃顆粒高劑量組下降差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其余各組血清ALDH含量均有所降低，但僅高劑量組降低無差異外，其余各組降低差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，血清ALDH含量在高、中、低劑量組均有所升高，升高趨勢依次遞減，但僅葛黃顆粒高劑量組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。高、中、低劑量組組間比較差異均無統計學意義。見表2。

2.4 各組大鼠肝組織CYP450 2E1蛋白表達比較

大鼠肝組織CYP450 2E1蛋白表達量組間比較差異有統計學意義。與正常組比較，除高劑量組外各組大鼠P4502E1蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，高、中劑量組P4502E1蛋白的表達均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與高劑量組比較，中、低劑量組P450 2E1蛋白的表達升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3和圖2。

表2 各組大鼠血清AST、ALT、ADH、ALDH的比較 （±s）

表2 各組大鼠血清AST、ALT、ADH、ALDH的比較 （±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.01；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 AST/（u/L） ALT/（u/L） ALDH/（u/ml） ADH/（u/ml）正常組 123.63±14.47 46.38±9.14 40.251±3.236 9.514±0.866模型組 161.33±12.431） 68.53±11.711） 27.082±4.0671） 13.914±0.8671）高劑量組 129.78±11.962） 54.67±10.012） 33.665±3.2362） 11.286±1.3842）中劑量組 148.43±14.501） 60.00±7.551） 31.181±4.7491） 12.130±1.5771）低劑量組 158.33±32.032） 63.11±4.422） 29.469±4.2912） 12.950±1.5211）F值 11.662 31.061 38.374 4.478 P值 0.001 0.000 0.000 0.004

表3 各組大鼠肝組織P4502E1蛋白表達的比較 （±s）

表3 各組大鼠肝組織P4502E1蛋白表達的比較 （±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.01；2）與模型組比較，P ＜0.05；3）與高劑量組比較，P ＜0.01

組別 P4502E1蛋白表達正常組 0.572±0.052模型組 1.482±0.1071）高劑量組 0.723±0.0631）2）中劑量組 1.056±0.0311）2）3）低劑量組 1.226±0.0211）3）F值 13.927 P值 0.000

圖2 各組肝組織CYP450 2E1蛋白表達的比較

3 討論

本研究結果顯示，酒精性肝損傷造模成功。同時與正常組比較，在模型組中ADH及CYP450 2E1均升高（P＜0.01），而ALDH卻降低（P＜0.01）。可見，在模型組參與乙醇第一條代謝途徑即ADH氧化體系中，因ADH升高及ALDH降低而導致模型組大鼠機體大量乙醛堆積，而乙醛具有很強的毒性，能使肝細胞線粒體受損，引起肝細胞膜脂質過氧化，同時還可與蛋白質結合形成乙醛復合體，導致蛋白質功能紊亂[5]。同時，模型組CYP450 2E1的升高可能是由于長期大量飲酒，血液中高濃度乙醇刺激第二條重要的乙醇代謝途徑MEOS活化所致[6]，該系統的活化會伴隨大量氧自由基的產生，這些氧自由基也會引起肝細胞膜及肝線粒體脂質過氧化反應致肝細胞損傷嚴重[7-8]。可見，模型組出現典型的酒精性肝損傷，可能與參與乙醇代謝的這3種關鍵酶活性的改變密切相關。在造模成功后給予不同劑量（高、中、低）的葛黃顆粒干預發現，與模型組比較，不同劑量（高、中、低）的葛黃顆粒均可逆轉以上3種酶活性，且存在一定的劑量-效應關系，即高劑量組逆轉效果最好，幾乎趨于正常值，其次是中劑量組。通過這些指標在不同組間的趨勢變化圖分析發現，這3種乙醇代謝酶在不同組間的逆轉趨勢與肝功指標及肝臟指數指標逆轉趨勢類似。可見，在葛黃顆粒干預下，3種酶不同程度的逆轉導致肝損傷不同程度的逆轉從而到達不同程度的治療效果，其中以高劑量組的治療效果最佳。

葛黃顆粒組方有葛花、白術、柴胡、丹參、虎杖、趕黃草、枳棋子、甘草等，其中葛花作為“解酒方”的君藥，研究發現：葛花可降低酒后血中乙醇濃度，推測其可能增強胃的首過代謝，抑制乙醇的胃腸道吸收進而抑制其在肝中的代謝[9]，同時葛花還具有消除患者肝內活性氧成分以減少脂質過氧化反應，進一步改善肝功能之功效[10]；柴胡和白術作為“解酒方”的臣藥，具有抑制自由基的生成，提高抗氧化能力，從而減弱脂質過氧化反應等保肝之功效[11-12]；枳棋子和丹參作為“解酒方”的佐藥，具有解酒，保護肝細胞及促進組織修復與再生之功效[13-14]；虎杖、趕黃草、甘草作為“解酒方”的使藥，具有降脂、抗氧化、保肝之功效[15]。可見，一定劑量的葛黃顆粒對酒精性肝損傷有一定的阻止及逆轉作用，其機制可能與葛黃顆粒復方藥物多靶點、多途徑共同協同進行降酒毒、逆轉ADH、ALDH等乙醇代謝酶的活性進而抑制自由基生成，促進毒物乙醛分解，最終起到解酒保肝以延緩或逆轉酒精性肝損傷發展進程的作用有關。