程序性死亡配體-1在食管鱗癌中的表達及臨床意義

姚童翔，原翔，劉怡文，夏金，張耀文，李劍，周福有

[1.新鄉醫學院，河南 新鄉 453003；2.河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，河南 洛陽471003；3.河南科技大學第四附屬醫院（安陽市腫瘤醫院）胸外科，河南 安陽 455000]

食管癌是我國常見的惡性腫瘤，中國疾病控制與預防中心數據顯示，食管癌在我國的每年發病人數約為22萬人以上，死亡人數每年則高達19+萬人[1]。食管 鱗 癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）是亞洲食管癌的主要病理類型，約占食管癌的90%以上[2]，河南省林州市及其毗鄰的輝縣，安陽等地是我國，也是世界上食管癌發病率和死亡率最高的地區[3]。大多數患者確診時已屬晚期或伴有遠處轉移，預后差，5年生存率極低[4]。腫瘤免疫抑制在促進腫瘤發展的同時減弱抗腫瘤治療的療效[5]，程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1, PD-L1）是一個主要的調控免疫抑制的分子，PD-L1屬于B7超家族，主要在T細胞、B細胞、樹突狀細胞、炎癥反應細胞和惡性腫瘤細胞中表達[6]，與程序性死亡-1（programmed cell death-1, PD1）結合后可以提供抑制性信號，抑制T細胞的活化和增殖，誘導T細胞凋亡，使腫瘤細胞逃避免疫殺傷[7]，PD-L1高表達于各種實體惡性腫瘤，并且可誘導T淋巴細胞的凋亡[8]，抗PD1/PD-L1通路的藥物在在黑色素瘤、非小細胞肺癌等領域取得很大的成功[9]，本研究將分析PD-L1在50例食管鱗癌患者中表達特征和其臨床意義及預后價值。

1 資料與方法

1.1 一般研究

選取2014年1月-2014年6月于河南科技大學第四附屬醫院（安陽市腫瘤醫院）接受手術治療的食管癌患者，50例食管鱗癌組織及相應癌旁組織（距腫瘤切緣＞5 cm）標本，全部患者均經病理學確診為食管鱗癌。男31例、女19例；年齡42～79歲，平均（61.3±8.3）歲；高分化+中分化40例、低分化10例；根據美國癌癥聯合會（AJCC）食管癌第7版TNM分期標準：Ⅰ期8例、Ⅱ期29例、Ⅲ期13例；發生淋巴結轉移13例。所有患者術前均未接受放化療及免疫治療，并于術前獲得患者書面知情同意。該項目通過醫院倫理委員會的同意。

1.2 免疫組織化學檢測PD-L1

采用免疫組織化學（簡稱免疫組化）SP超敏試劑盒（中杉金橋產品編號SP-9000）檢測食管癌及其相應癌旁組織中PD-L1（抗兔單克隆抗體1∶200，Abcam）的表達。由2位副高職稱以上的病理醫師雙盲閱片，隨機挑選5個高倍鏡視野觀察，根據染色強度（0，陰性；1，弱陽性；2，中度陽性；3，強陽性）和陽性腫瘤細胞數（0，＜5%；1，5%～25%；2，25%～75%；3，≥75%）乘積對每個視野進行免疫評分：0為陰性；1～12為陽性，5個視野免疫評分均值為最終結果。

1.3 Western blot檢測PD-L1

提取組織蛋白后，用BCA法進行蛋白定量（康為）。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行上層膠恒壓90 V/30 min，下層膠恒壓120 V/60 min電泳，切膠后采用“三明治夾心法”，恒壓90 V/150 min轉膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，TBST清洗1次，30 s/次，加入PD-L1兔一抗（1∶1 000，Abcam）和內參GAPDH（1∶2 000康為）4℃過夜，TBST清洗3次，5 min/次，加入兔二抗（1∶2 000，康為）室溫孵育2 h，再用TBST漂洗3次，5 min/次，ECL（美國invitrogen公司）處理PVDF膜后用凝膠成像系統（美國BIO-RAD公司）檢測目的蛋白條帶，Image Lab軟件對蛋白條帶灰度進行定量分析。

1.4 隨訪

50例食管鱗癌患者術后隨訪時間30個月。生存時間定義為手術日期至最后一次隨訪日期或死亡，未刪失數據為由食管癌導致的死亡患者，刪失數據為隨訪至30個月仍存活患者。

1.5 統計學方法

數據進分析采用SPSS 23.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用配對t檢驗；計量資料采用χ2檢驗。應用Kaplan-Meier繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間差異，單因素分析應用Log-rank檢驗，多因素Cox回歸計算風險比例（hazard ratios, HR）及其95%CI，分析各因素對食管鱗癌預后的影響，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌與癌旁組織中PD-L1蛋白的表達情況

PD-L1的陽性表達為胞膜出現棕黃色顆粒，部分胞漿也有表達。部分食管鱗癌及癌旁組織中可見PD-L1陽性表達。食管鱗癌組織組與相應癌旁組織組比較，差異有統計學意義（χ2=13.848，P=0.006），食管鱗癌組織中PD-L1陽性表達率高于相應癌旁組織組，且隨著分化程度的降低，PD-L1免疫組化評分逐漸升高。見表1和圖1。

表1 組織樣本中PD-L1蛋白表達

圖1 食管鱗癌中PD-L1的表達 （IHC×400）

2.2 食管癌與癌旁組織中PD-L1蛋白的表達

PD-L1蛋白的分子量約為33 kD。應用Image lab軟件將灰度值進行定量分析，并對結果進行統計學分析，食管鱗癌組織組與相應癌旁組織組比較，差異有統計學意義（t=3.612，P=0.000），食管鱗癌組織組PD-L1蛋白表達（灰度均值為4.086±1.060）高于相應癌旁組織組（灰度均值為1.884±0.642）。見圖2。

2.3 PD-L1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的相關性

PD-L1蛋白表達與腫瘤浸潤深度及臨床分期相關。見表2。

2.4 PD-L1蛋白表達水平與食管鱗癌患者預后

50例食管鱗癌患者術后30個月的總生存率為66%；PD-L1陽性表達組30個月生存率（38.1%）低于陰性組（86.2%）（χ2=14.311，P=0.000）。見圖 3。

圖2 食管鱗癌及相應癌旁組織中PD-L1蛋白表達

表2 PD-L1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的相關性例（%）

分化程度、淋巴結轉移、TNM分期及PD-L1蛋白表達與食管鱗癌患者生存預后相關（見表3）。多變量Cox回歸分析結果顯示，淋巴結轉移與PD-L1表達是食管鱗癌患者生存的預后因素。見表4。

表3 食管鱗癌患者預后Log-rank檢驗

表4 食管鱗癌患者預后的多因素Cox回歸分析

圖3 食管鱗癌患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

腫瘤免疫逃逸是腫瘤發生、發展過程中的關鍵環節。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）被認為是機體對腫瘤細胞特異性免疫反應的效應細胞[10]，臨床研究表明，TIL在腫瘤（包括食管癌）中發揮關鍵作用并具有預后意義[11]。由于腫瘤組織不表達或極少量表達MHCⅡ類分子，因此認為抗腫瘤特異性免疫的效應細胞主要為CD8+T細胞，腫瘤特異性CD8+T細胞均高表達PD1，同時許多腫瘤細胞高表達PD-L1分子[12]，PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細胞表達的PD1結合后，可導致PD1胞質區的免疫受體酪氨酸轉化基序（ITSM）結構域磷酸化，導致下游信號受到抑制，阻斷Akt和PI3K的活性，干擾IL-2的分泌，減弱TCR/CD28信號對免疫細胞的活化作用[13]，最終抑制T淋巴細胞增殖和相關細胞因子的分泌，進而抑制機體的抗腫瘤免疫。除了能直接抑制TIL的功能外，PD-L1還可以通過調節T細胞分化調節抗腫瘤免疫，研究[14]表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg是具免疫負性調節功能的細胞群，通過細胞分泌白介素10、轉化生長因子β等免疫負性細胞因子抑制免疫應答。PD-L1可促進CD4+CD25+Foxp3-T向CD4+CD25+Foxp3+Treg轉化[15]，使用單克隆抗體阻斷PD-L1，可減少Treg產生，并且Treg凋亡加速。GENG等[16]發現，PD-L1能有效促進Treg分泌白介素10，進而發揮免疫抑制作用。本研究均表明PD-L1在腫瘤免疫逃逸過程中發揮重要作用。

腫瘤浸潤和轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征，也是影響腫瘤患者預后的主要因素。上皮細胞間質化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮細胞失去極性，細胞間緊密連接及黏附連接消失，變成了具有間質細胞形態和功能的細胞，Ⅲ型EMT與腫瘤的浸潤和轉移有關[17]，人體90%以上惡性腫瘤是上皮性腫瘤，由于EMT是上皮細胞獲得遷移能力的有效途徑，因此EMT成為癌癥浸潤轉移的重要途徑之一。CAO等[18]在小鼠皮膚腫瘤模型中發現，PD-L1可促進腫瘤細胞中轉錄因子Slug和Twist的表達，抑制上皮性鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達，從而促進EMT的發生，同時在體內實驗也證實了PD-L1的過表達可促進EMT的發生。cop9信號小體5（cop9 signalosome 5,CNS5）是CNS的重要組成部分，能增強腫瘤的侵襲、轉移能力[19]，LIM等[20]通過構建乳腺癌模型，發現腫瘤壞死因子（TNF-α）通過活化p65，促進CSN5表達，CSN5和PD-L1結合后，可使PD-L1去泛素化，增強PD-L1穩定性。本研究表明PD-L1在腫瘤的侵襲、轉移過程中起到重要作用。

本研究表明，PD-L1在食管癌組織的表達高于其相應癌旁組織，這與CHEN[4]、OHIGASHIO[21]研究結果一致。CHEN[22]通過免疫組化檢測PD-L1在食管癌細胞的表達情況，顯示PD-L1主要在細胞漿和細胞膜表達，部分細胞核也有表達，但本組資料僅檢測到PD-L1在細胞漿和細胞膜表達。本研究顯示，PD-L1的表達水平與食管癌患者性別、年齡、分化程度、區域淋巴結轉移無相關性，而與浸潤范圍、TNM分期相關。PD-L1高表達患者比低表達患者的死亡風險更高，Cox回歸分析結果顯示PDL是食管癌獨立預后因素，與CHEN[22]、LOOS等[23]結果一致。

PD-L1在食管鱗癌的發生、發展中發揮重要作用，可作為食管鱗癌預后判斷的潛在指標。PD1/PD-L1通路的激活可導致免疫抑制性腫瘤微環境形成，使腫瘤發生免疫逃逸，而阻斷PD1/PDL信號通路可以逆轉腫瘤免疫微環境，增強內源性抗腫瘤免疫效應[24]。因此，探討PD-L1與食管鱗癌發生、發展的關系，進一步研究PD-L1在食管鱗癌發生、發展中的分子機制，使之成為食管鱗癌治療的新靶點，為食管癌開辟新的治療途徑。