程序性死亡配體-1表達對I期肺腺癌術后患者預后的價值

肖鵬，張曉，靳超

（鄭州大學附屬洛陽市中心醫院，河南 洛陽 471009）

肺腺癌屬于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），占肺癌總數的85%，是肺癌最常見的組織學類型。該病在全球范圍內的發病率逐年上升，其發病率和死亡率均很高，其中死亡率平均每年增長約7.7%[1]。肺腺癌發病多見于女性，術后5年生存率≤10%。早期肺腺癌因癌細胞侵襲程度和淋巴結轉移機率均較小，首選治療方式為肺葉切除聯合淋巴結清掃術。程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）作為生物標志物，在多種腫瘤的發生、發展中起到重要作用。美國食品藥品監督管理局于2015年批準兩種免疫抑制劑應用于NSCLC的臨床治療中[2]，說明其對肺癌的治療起到重要的作用。本文探討PD-L1的表達對I期肺腺癌經電視胸腔鏡下解剖性肺段切除聯合系統性淋巴結清掃術后結局的預測價值研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年4月-2012年12月該院經手術活檢確診并經接受治療的86例Ⅰ期浸潤性肺腺癌患者，腫瘤直徑大小≤3 cm。其中，男性54例，女性32例；年齡25～76歲，平均59.3歲，中位年齡62歲。按照國際肺癌研究會（international association for the study of lung cancer, IASLC）最新發布的第7版關于肺癌TNM分期診斷標準：ⅠA期49例，ⅠB期37例；按照美國東部腫瘤協作組（eastern cooperative oncology, ECOG）體能狀況評分在0～2分；所有患者均為周圍型。納入標準：①接受電視胸腔鏡下解剖性肺段切除聯合系統性淋巴結清掃術的Ⅰ期肺腺癌；②有病理學診斷依據，同時結合PET-CT及臨床癥狀檢查；③KPS評分≥70分。排除標準：①伴有心、肝、腎及腦部等嚴重疾病；②其他類型的肺癌；③治療過程中出現遠處轉移或者不可逆的4級毒性反應；④有放化療禁忌證且3個月內接受放化療治療；⑤依從性差或任何原因導致的不能繼續接受治療。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 手術方法 所有患者術前需要行常規檢查（如心電圖、肺功能檢測及胸腹部CT），對部分患者行CT三維重建，確定靶段血管、支氣管有無變異。對確診為肺癌的患者行頭部MRI及全身核素骨顯像檢查，從而排除肺外轉移。小結節病例術前行CT定位、注入亞甲藍并置入定位鋼絲，提高準確率及手術成功率。所有受試對象均給予雙腔氣管插管進行麻醉、單肺通氣，取健側90°臥位，腋下墊枕，調整手術床為折刀位。于腋前線第7肋間，切長約1.5 cm切口作為觀察孔；在腋前線第4、5肋間切長約3～5 cm切口作為主操作孔；于腋后線第7、8或8、9肋間切長約1.5 cm切口作為副操作孔。采用電凝鉤或超聲刀解剖分離靶段靜脈、動脈及支氣管，在電視胸腔鏡下用直線切割縫合器閉合切斷。靶段與臨近肺段交界的確定：①待靶段支氣管夾閉后張肺，確定未涉及的其余肺段；②靶段支氣管夾閉后張肺，靶段所在肺葉膨脹后單肺通氣，其余肺段肺塌陷、與充氣的肺段之間形成界限，沿此界限采用直線切割器切斷。手術中需要注意事項為：①確定具有足夠的切緣，切緣在≥1 cm或切緣/腫瘤直徑=1 cm；②術中需要將縱隔、肺門、葉間、段間淋巴結及靶段、切緣快速冷凍送檢，若淋巴結陽性則改為肺葉切除術；③淋巴結清掃范圍主要包括N2、N1和靶段的11、12及13組；④術中需預防剩余肺段扭轉，縫合或切割縫合器固定。

1.2.2 臨床資料收集 收集患者臨床資料[年齡、性別、臨床癥狀（包含咳嗽、痰血、低熱及胸痛或胸悶等）、吸煙史、家族史、胸膜受累、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、術后ECOG評分、病理類型（鱗屑樣、腺泡樣、乳頭狀、實性和微乳頭狀）及術后是否進行輔助治療等]。術前CT掃描診斷肺腺癌患者磨玻璃樣影（pure ground glass opacity, GGO），按照結果分為純GGO、混合GGO及實行結節。其中純GGO是指輕微且均勻的密度增加，但未掩蓋肺內血管；混合GGO則為GGO合并實性成分；純實性結節則僅為固體成分，無任何磨玻璃外觀。

1.2.3 外周血標本的收集及處理 所有患者均在術后第7天清晨，空腹并抽取肘靜脈血3 ml，7℃放置0.5 h后以2 500 r/min離心15 min，分離血清后于-40℃冰箱中冷凍保存。抽取患者肘靜脈血時需要記錄患者的臨床診治及隨訪情況。

1.2.4 酶聯免疫法檢測 血清中sPD-L1水平將抗體包被稀釋至所需要濃度，并按100 μl/孔加入到96孔板中，密封室溫過夜，洗滌、吸干。每孔再加入300 μl的試劑稀釋液，室溫孵育至少1 h。洗滌、吸干后，每孔加入100 μl的樣品封蓋，室溫孵育2 h。洗滌吸干后，每孔加入100 μl含有2% N-氯化丁二酰亞胺的檢測抗體，蓋板室溫孵育2 h。洗滌吸干后，加入100 μl的顯色劑，避光、室溫孵育20 min。將上述液體保留并加入50 μl終止液到每孔中。采用酶標儀在450 nm檢測吸光度值（A450 nm）。建立以PD-L1抗體水平為橫坐標，A450 nm為縱坐標繪制標準曲線，檢測樣本中可溶性程序性死亡配體-1（sPD-L1）水平。

1.2.5 隨訪所有受試對象 采用電話詢問、門診隨診等方式進行隨訪。隨訪截止時間為2017年5月1日，中位隨訪時間為48個月；隨訪主要詢問患者并發癥、生活狀況、術后3年內復發及5年內的生存情況等。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以M（95%CI）表示，PD-L1的表達與Ⅰ期肺腺癌病理特征關系使用單因素方差分析或t檢驗，利用Kaplan-Meier生存曲線分析sPD-L1的表達對術后療效的預測，采用Long-rank test分析曲線的差異，Cox比例風險模型對Ⅰ期肺腺癌術后預后行多因素回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 sPD-L1表達與Ⅰ期肺腺癌患者臨床病理特征關系比較

術后sPD-L1表達水平在有胸膜受累者，低分化、病理分期Ⅰb期高于無臨床癥狀、胸膜受累者、中高分化、病理分期Ⅰa期。經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.897、11.116、9.264 及 8.667，P=0.031、0.000、0.003及0.003）；術后不同ECOG評分、病理類型及GGO狀態比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=9.026、12.403 及 10.147，P=0.003、0.000 及 0.001）。不同病理類型間sPD-L1表達也有差異（F=12.403，P=0.000）。見表 1。

表1 sPD-L1表達與Ⅰ期肺腺癌患者臨床病理特征關系比較 （μg/L，±s）

表1 sPD-L1表達與Ⅰ期肺腺癌患者臨床病理特征關系比較 （μg/L，±s）

變量 例數 sPD-L1水平 F /t值 P值性別男54 0.84±0.07 0.049 0.815女32 0.82±0.08年齡≥60歲 49 0.83±0.08 0.104 0.764＜60歲 37 0.80±0.09臨床癥狀有25 0.93±0.08 4.897 0.031無61 0.80±0.08胸膜受累有28 1.08±0.08 11.116 0.000無58 0.70±0.10家族史有17 0.83±0.08 0.037 0.863無69 0.82±0.08吸煙無21 0.80±0.08≤400支/年 39 0.85±0.08 0.413 0.497＞400支 /年 26 0.89±0.07術后ECOG評分0 33 0.55±0.07 1 26 0.70±0.07 9.026 0.003 2 27 0.99±0.09變量 例數 sPD-L1水平 F /t值 P值腫瘤直徑＜2.0 cm 44 0.83±0.09 1.193 0.117 2.0～3.0 cm 42 0.86±0.09病理分期Ⅰa 49 0.67±0.08 8.667 0.003Ⅰb 37 0.97±0.09分化程度低分化 31 0.97±0.09 9.264 0.003中高分化 55 0.66±0.08病理類型鱗屑樣為主型 21 0.92±0.08腺泡樣為主型 28 0.81±0.08乳頭狀為主型 18 0.88±0.07實性為主型 8 0.61±0.06微乳頭狀為主型 11 0.42±0.06術后輔助治療是48 0.721±0.073 12.403 0.000 7.993 0.009否38 0.926±0.082 GGO狀態純GGO 33 0.57±0.06混合GGO 38 0.79±0.07 10.147 0.001純實性成分 15 0.98±0.09

2.2 ROC曲線分析sPD-L1表達與術后復發和生存的預測價值

通過繪制ROC曲線，結果顯示，sPD-L1對術后復發的預測價值：敏感性為0.786，特異性為0.809，曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.730（95%CI：0.671，0.876）。當 Yuden指數最大時，sPD-L1診斷術后復發的臨界值為0.650 μg/L。sPD-L1對術后生存的預測價值：敏感性為0.799，特異 性 為 0.837，AUC=0.771（95%CI：0.685，0.907）。當Yuden指數最大時，sPD-L1診斷術后生存的臨界值為0.672 μg/L。見圖1。

2.3 sPD-L1表達與Ⅰ期肺腺癌患者術后5年復發的關系研究

通過繪制ROC曲線，確定術后5年復發的sPD-L1表達最佳臨界值為0.650 μg/L，并進行分組。結果顯示，sPD-L1高表達組（＞0.650 μg/L）術后5年復發率高于低表達組（≤0.650 μg/L），經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），平均復發時間短于低表達組（≤ 0.650 μg/L）（P＜0.05）。見表 2。

2.4 總生存率的單因素分析

單因素分析顯示，胸膜受累、術后ECOG評分、分化程度、臨床分期、病理類型、GGO狀態及sPD-L1表達為患者3、5年生存的影響因素（P＜0.05）。見表3。

2.5 Cox模型多因素分析

以術后患者生存與否為自變量（0為死亡，1為生存），以5年生存率單因素分析結果中有統計學意義因素為因變量行Cox模型分析。結果顯示，ECOG評分、PD-L1、分化程度、臨床分期、GGO狀態及胸膜受累為術后預后的影響因素（P＜0.05）。見表4和圖2。

圖1 ROC曲線對術后肺腺癌患者預后的預測價值

表2 不同sPD-L1表達量術后5年復發率及復發時間的比較

3 討論

肺癌組織學類型有腺癌、鱗癌、支氣管肺泡癌、小細胞肺癌及大細胞肺癌等，其中肺腺癌是肺癌最常見的組織學類型。早期NSCLC患者多以手術治療，目前治療NSCLC的手術方式為肺葉切除術、亞肺葉切除術等。有報道指出[3]，解剖型肺段切除聯合系統性的淋巴結清掃被認為是治療心肺功能差的早期NSCLC患者的最佳治療選擇，尤其是Ⅰa期NSCLC患者。需要指出的是，對于肺段切除術患者，國內外均認為需要符合以下指征：腫瘤直徑≤2 cm的周圍型肺癌，且至少滿足以下1條特例：即CT掃描顯示GGO成分≥50，影像學診斷明確結節倍增時間≥400 d；鼓勵性轉移瘤或者良性病變[4]。本研究主要采用肺葉切除術治療，其也是目前治療肺癌的最無爭議的手術治療方案。

表3 總生存率的單因素分析

表3 總生存率的單因素分析

表4 Cox模型多因素分析

圖2 Kaplan-Meier法分析不同臨床因素對術后生存的影響

臨床研究發現[5]，Ⅰ期NSCLC患者術后有30%～40%的患者出現術后復發或者轉移。本研究顯示，入選的86例患者中有32例出現術后復發，復發率為37.21%，基本符合以往的研究報道。有研究顯示[6]，Ⅰa期與Ⅰb期NSCLC患者術后5年生存率分別為73%、54%，表明臨床分期對于患者術后生存有重要影響，也說明肺癌患者越早發現預后越好，提示定期體檢對健康的重要性。Ⅰa期5年內生存率高于Ⅰb期，該結論與劉洋等研究報道基本一致[7]，其認為Ⅰb期患者可能存在淋巴結轉移的風險，建議患者采用肺葉切除術治療。本研究發現采用肺葉切除術患者預后仍然較差，表明Ⅰb期患者深層浸潤或者淋巴結轉移的風險高于Ⅰa期。

GGO對于早期肺腺癌具有一定的提示作用。研究發現[8]，肺腺癌表現為GGO具有良好的預后，這類患者多數病理特征表現為腫瘤細胞侵襲性較弱，但混合性GGO或純實性結節更容易出現淋巴結轉移。有研究采用單因素分析發現[9]，混合性GGO或純實性結節與患者術后淋巴結轉移具有相關性，但多因素分析未證實到這一作用。本研究通過多因素分析發現，GGO狀態與患者預后有相關性。筆者認為混合性GGO患者或純實性結節患者易導致淋巴結轉移，導致患者術后更易復發，術后預后不良。

2011年，ISALC/ATS/ERS提出肺腺癌新的國際多學科分類，提出原位肺腺癌和微浸潤性腺癌。其中對浸潤性肺腺癌又分為6個亞型，鱗屑樣為主型的肺腺癌患者5年的生存率近100%，而微乳頭型和實性為主型的肺腺癌患者預后較差[10]。通過本研究，筆者也發現微乳頭型和實性為主型的肺腺癌術后生存率低于鱗屑樣為主型的患者，這與以往的研究報道基本一致。

sPD-L1的表達與I期肺腺癌患者胸膜受累、臨床分期、病理類型及GGO狀態及術后ECOG評分等存在相關性。TOPALIAN[11]等人研究認為，PD-L1在Ⅰ期肺癌中陽性表達的患者客觀緩解率為36%，陰性表達組的緩解率為0%，這與筆者研究結果較為一致。而VELCHETI等[12]人研究結果，PD-L1高表達的患者總生存時間更久，與患者的臨床病理特征如年齡、性別及組織類型等無關。這與筆者的研究結果部分一致。YANG等[13]的研究提示PD-L1在Ⅰ期肺腺癌患者中的高表達可使患者具有更長的無復發生存時間。大部分研究認為，PD-L1在腫瘤細胞中的高表達均提示疾病預后不佳[14]。本研究采用單因素以及Cox模型比例分析顯示，sPD-L1高表達為Ⅰ期肺腺癌患者術后復發、預后生存的危險因素，目前國內外有較多學者均已經證實PD-L1與癌癥的發生、發展密切相關。

綜上所述，sPD-L1高表達為Ⅰ期肺腺癌患者經電視胸腔鏡肺葉切除聯合系統淋巴結清掃術后復發、預后生存的危險因素。