結直腸腺癌EGFR、CDX2表達的臨床病理意義及相互關系*

錢紅，王輝，牛國梁，趙娟霞，曹桂明

（南華大學附屬南華醫院 1.病理科，2.胃腸外科，3.腫瘤科，湖南 衡陽 421002）

結直腸腺癌（colorectal adenocarcinoma, CRC）是人類常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率在我國已呈逐年上升趨勢，其發生、發展可能是在遺傳、環境等多種因素作用下發生的一個多步驟、多階段的復雜過程，具體機制尚不清楚。研究證明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和尾型同源框轉錄因子2（caudal type homeobox genes 2,CDX2）在腫瘤細胞的增殖、分化、遷移以及預后方面發揮重要作用，但在結直腸腺癌中EGFR和CDX2對患者臨床病理表現的影響和意義以及它們相互之間的關系研究結論不一。本實驗采用免疫組織化學方法檢測結直腸腺癌及正常腸黏膜中EGFR和CDX2的表達，并結合臨床、病理資料進行分析探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年10月南華大學附屬南華醫院病理科結直腸腺癌手術標本170例。所有患者術前均未進行放射或化學治療。選取30例無癌患者正常腸黏膜作對照，男女比為19∶11，中位年齡51歲，平均年齡59歲。

1.2 方法

所有腫瘤標本均經10%中性甲醛固定12～48 h，常規脫水、石蠟包埋切片，HE和免疫組織化學染色，由兩名病理診斷醫生雙盲作出病理診斷、組織學分類及免疫組織化學染色結果判斷，意見不一致的再共同討論決定。病理診斷及組織學分類按照WHO（2010版）標準。免疫組織化學用SP法染色，試劑盒及抗體購于福州邁新生物技術開發有限公司；EGFR（RMA-0689）、CDX2（EPR2764Y）均為即用型兔抗人單克隆抗體。操作步驟嚴格按照說明書進行，以已知陽性切片做陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。

1.3 結果判定標準

顯微鏡下觀察，EGFR陽性染色定位于細胞膜和/或細胞質，CDX2陽性染色定位于細胞核；染色為淡黃色、棕黃色或深棕色為陽性；按照以下標準進行計分：①陽性染色判定標準：未染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，深棕色3分；②陽性細胞數判定標準：按每400高倍視野陽性細胞占腫瘤細胞的百分比：＞1%0分，1%～24% 1分，25%～50% 2分；＞50% 3分；③以上兩項評分乘積為最后得分：＜中位分值為低表達，≥中位分值為高表達。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，計數資料用例表示，采用χ2檢驗和χ2分割法（檢驗水準經矯正后α=0.008）；EGFR和CDX2的相關性采用Spearman等級相關分析及χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸腺癌的臨床病理特征

170例結直腸腺癌患者年齡28～85歲，中位年齡62歲，平均60歲；＜60歲的73例（42.9%），≥60歲的97例（57.1%）；男性112例（65.9%），女性58例（34.1%），男女比1.9∶1；腫塊最大徑0.8～15 cm，中位4 cm，平均4.3 cm，其中最大徑＜4 cm的96例（56.5%），≥4 cm的74例（43.5%）；浸潤至黏膜肌層9例（5.3%），浸潤肌層33例（19.4%），侵及全層或外膜脂肪組織128（75.3%）例；有淋巴結轉移55例（32.4%），神經侵犯30例（17.6%），脈管內癌栓或血管壁侵犯29例（17.1%），系膜或網膜出現癌結節26例（15.3%）；高、中、低分化腺癌分別為44、100、26例，分別占總例數的25.9%、58.8%、15.3%。

2.2 EGFR在結直腸腺癌和正常腸黏膜組織中的表達

結直腸腺癌中EGFR細胞膜和/或細胞質呈不同程度的淡黃色至深褐色著色（見圖1）。170例結直腸腺癌EGFR免疫組織化學染色最后綜合得分中位數為4分，因此選定＜4分者為低表達，≥4分者為高表達；EGFR高、低表達分別為61例（35.88%）及109例（64.12%），其中高、中、低分化腺癌的EGFR高表達率分別為31.82%、35.00%、46.15%，并且隨著腺癌分化程度的降低而逐漸增加。正常腸黏膜中EGFR主要為細胞膜著色；30例對照組中EGFR高表達3例，高表達率為10.00%。不同分化程度結直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較，差異有統計學意義（χ2=9.481，P=0.024），然后進行χ2分割法比較，結果顯示，中分化與低分化結直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較差異有統計學意義（P＜0.008），而高分化結直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較無統計學差異（P＞0.008）。但不同分化程度的結直腸腺癌EGFR高表達率兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.3 CDX2在結直腸腺癌和正常腸黏膜上皮中的表達

圖1 結直腸腺癌EGFR表達 （SP×400）

表1 不同分化程度的結直腸腺癌及正常腸黏膜EGFR表達

圖2 結直腸腺癌CDX2表達 （SP×200）

CDX2在結直腸腺癌及正常腸黏膜上皮中均為細胞核著色，呈不同程度的淺棕黃色至棕褐色顆粒樣，近核周的胞質中也有少量顆粒樣著色（見圖2）。CDX2高、低表達分別為143例（84.12%）及27例（15.88%），其中高、中、低分化腺癌的CDX2高表達率分別為90.92%、87.00%和61.54%。30例正常腸黏膜中CDX2均呈高表達，表達率為100%。不同分化程度的結直腸腺癌組織與正常腸黏膜CDX2高表達率比較，差異有統計學意義（χ2=12.063，P=0.002），然后進行χ2分割法比較，結果顯示，低分化結直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達率比較差異有統計學意義（P＜0.008），而高分化與中分化結直腸腺癌的CDX2高表達率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達率比較差異均無統計學意義（P＞0.008）。但不同分化程度的結直腸腺癌CDX2高表達率兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同分化程度的結直腸腺癌組織及正常腸黏膜CDX2表達情況

2.4 EGFR和CDX2蛋白表達與結直腸腺癌臨床病理表現的關系

170例結直腸腺癌中，EGFR表達與年齡、性別、分化程度、腫塊直徑、淋巴結轉移、系膜或網膜癌結節形成、浸潤深度、神經侵犯、脈管癌栓形成均無關，差異無統計學意義（P＞0.05）；但CDX2表達與分化程度、淋巴結轉移和脈管內癌栓形成有關（P＜0.05），其中，低分化結直腸腺癌的CDX2高表達率（61.54%）低于高分化及中分化結直腸腺癌的高表達率（90.92%及87.00%），差異有統計學意義（P＜0.05）；無淋巴結轉移者CDX2高表達率（86.96%）高于淋巴結轉移者（78.18%），差異有統計學意義（P＜0.05）；無脈管內癌栓形成者CDX2高表達率（86.52%）高于脈管內癌栓形成病例（72.41%），差異有統計學意義（P＜0.05）；但CDX2蛋白表達與年齡、性別、腫塊直徑、系膜或網膜癌結節的形成、浸潤深度、神經侵犯等無關（P＞0.05）。見表 3。

2.5 EGFR與CDX2表達的相關性

EGFR高表達的61例中，CDX2高表達8例，低表達53例，高表達率為13.11%；EGFR低表達的109例中，CDX2高表達90例，低表達19例，高表達率為82.57%。EGFR和CDX2蛋白表達的Spearman相關分析（r=0.057，P=0.463）及χ2檢測（χ2=0.545，P=0.518）結果均提示兩者無相關性，見表4。

表3 結直腸腺癌EGFR和 CDX2蛋白表達與臨床病理參數之間的關系

表4 結直腸腺癌CDX2與EGFR表達的相互關系 例（%）

3 討論

EGFR是一種具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體，通過介導多種途徑的信號通路調控細胞生長、遷移、黏附、增殖、分化、凋亡和存活，并與腫瘤的形成、侵襲、轉移及血管生成、細胞凋亡的抑制和惡性轉化密切相關。結直腸腺癌中EGFR表達上調，與預后差、轉移快、復發早、生存期短及化療耐藥等相關[1-3]。免疫組織化學檢測是目前臨床評價EGFR表達的常用方法之一[4]，但報道的EGFR表達率差異較大。為了更準確地反應結直腸腺癌中EGFR蛋白陽性表達的范圍和程度，本組采用復合性評分系統[5]，以陽性結果評分與陽性細胞數評分的乘積作為最后得分。本研究顯示，隨著分化程度的降低，EGFR高表達率逐漸增加，尤其是中分化與低分化結直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較差異有統計學意義，表明EGFR高表達與結直腸腺癌的發生及分化程度關系密切，與文獻報道一致[3，6-7]。但EGFR表達與年齡、性別、分化程度、腫塊直徑、淋巴結轉移、系膜或網膜結節的形成、浸潤深度、神經侵犯、脈管內癌栓形成均無關，而且高分化結直腸腺癌的EGFR高表達率與正常腸黏膜上皮EGFR高表達率比較差異亦無統計學意義，提示EGFR蛋白表達不適合單獨作為轉移性結直腸腺癌的預后指標，與部分研究報道不一致[7-8]，這可能與EGFR表達的判定標準不同，或與本組結直腸腺癌大多屬臨床中晚期有關。此外，有學者提出引起結直腸腺癌細胞增殖和遷移的EGFR的轉錄機制存在多種信號通路[9-10]，這也提示不能通過單一分子的表達來評判腫瘤的發生、發展。

CDX2是一種特異性的腸道核轉錄因子，亦是腸道腫瘤發生機制中發揮作用的一個關鍵因子[11]。有文獻報道[12-16]，CDX2是一種抑癌基因，特異性表達于腸上皮性腫瘤中，在引導和維持腸上皮形態和功能方面具有重要作用，能夠調節大量腸道特異性基因的表達，與結直腸腺癌的發生發展有著密切關系。本研究結果顯示，CDX2對診斷結直腸腺癌具有敏感性，是結直腸腺癌診斷和鑒別診斷的良好指標。本組高、中、低分化結直腸腺癌中，CDX2高表達率均低于正常腸黏膜CDX2表達，表明結直腸腺癌中的CDX2蛋白表達受到抑制；尤其是低分化結直腸腺癌的CDX2高表達率低于高、中分化結直腸腺癌，而且低分化結直腸腺癌的CDX2高表達率與正常腸黏膜上皮CDX2高表達率比較差異有統計學意義，說明CDX2的表達隨結直腸腺癌細胞分化程度降低而下調，分化越差，下調越明顯，這種現象也提示CDX2具有引導和維持腸上皮形態和功能的作用，支持CDX2是一種抑癌基因的觀點。

本研究還發現，29例脈管內癌栓形成的結直腸腺癌患者，其CDX2高表達率低于無脈管內癌栓形成患者，而55例淋巴結轉移患者中CDX2高表達率也低于無淋巴結轉移患者；說明CDX2蛋白表達與結直腸腺癌發生轉移有一定關系；這也反過來證明了CDX2高表達具有抑制結直腸腺癌進展的作用，CDX2蛋白下調可提高結直腸腺癌的惡性程度和轉移能力，進一步證實CDX2是一種抑癌基因。有學者[16-18]認為CDX2過表達時能逆轉上皮間質轉化，從而抑制胃癌、腸癌細胞遷移、侵襲，因此推測結直腸腺癌CDX2表達缺失可能通過促進癌組織發生上皮間質轉化而導致侵襲能力的增強及血管和淋巴結轉移的發生，但該假設還需要進一步深入研究。

此外，EGFR蛋白高表達的結直腸腺癌中，CDX2蛋白多呈低表達，比例高達86.89%，而EGFR蛋白低表達的結直腸腺癌患者，其CDX2蛋白82.57%呈高表達，似乎提示EGFR與CDX2蛋白表達存在負相關，不過Spearman相關分析及χ2檢驗均未證實該推測。分析原因，可能與EGFR及CDX2參與腫瘤發生發展的途徑存在不同通路有關，但這還有待于大樣本數據進行分析和深入研究。總之，探討多個結直腸腺癌相關基因的表達及其相互關系，才能更全面的了解其發生發展和預后，以期為臨床診療和篩選高危人群提供重要的參考意義。