酵母雙雜交篩選與小鼠維生素D受體互作的蛋白

張 濤，白 皓，王 令，路宏朝，杜偉立，劉 歡，楊理凱

(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中 723001)

維生素D受體(Vitamin D receptor, VDR)是一種核轉錄因子，屬于類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員。VDR廣泛分布于各種組織細胞，包括腎臟、骨骼、腸道等維生素D靶器官，以及泌尿生殖系統(乳腺、前列腺、卵巢、子宮等)，血液淋巴系統(T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞等)，神經系統及甲狀旁腺等[1-2]。維生素D在體內主要活性代謝產物是1,25-二羥膽骨化醇(1,25- dihydroxyc-holecalciferol, 1,25-(OH)2D3)，其生物活性主要是通過VDR介導[3]，在靶細胞中，1,25二羥維生素D(1,25D)與VDR形成激素受體復合物，結合在靶基因啟動子區的維生素D受體應答元件(VDRE)調節其表達，最終通過靶基因影響體內血鈣和磷酸鹽平衡、腎小管鈣的重吸收及骨骼中鈣的再吸收等[4-5]。近期研究表明，除了VDR調節鈣和礦物質平衡以外，VDR還可以通過調控AKT、Wnt/β-Catenin等關鍵信號通路抑制細胞增殖，刺激細胞成熟等其他方面作用，涉及多種組織(皮膚、結腸、免疫系統、前列腺和乳房等)[4-6]。此外，VDR缺乏可能會增加患心血管疾病、炎癥、糖尿病、干擾毛囊循環及生殖類疾病的風險[7-8]。最新臨床研究證實，在小鼠睪丸組織中1,25-(OH)2D3與VDR作用調控精原細胞及精子鈣離子轉運、鹽離子平衡，進而影響精子形成及精子活力，同時VDR在睪丸與附睪內調控芳香化酶(雌激素生成關鍵酶)的表達，影響雌二醇濃度、精液濃度、精子活力等[9]。本研究基于酵母雙雜交技術從小鼠cDNA文庫中篩選與VDR互作的蛋白因子，檢測相互作用能力，并分析候選蛋白是否與生殖功能相關，為進一步探索VDR調控雄性小鼠生殖能力的分子機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

釀酒酵母菌株AH109、PGBKT7質粒、EscherichiacoliTop10(E.coliTop10)由陜西理工大學生物科學與工程學院分子遺傳學實驗室保存；含酵母小鼠胚胎cDNA文庫，RNA提取試劑盒，核酸內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ等酶購自大連寶生物工程公司；一抗為兔抗小鼠VDR單克隆抗體，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為二抗購自CST公司；ONPG、TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000、低分子質量標準蛋白購自Thermo Fisher公司；PVDF膜、質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自BioFlux公司；基因序列測序、引物合成由北京奧科鼎盛生物有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank公布的小鼠VDR基因序列(CT010294.1)設計上下游引物(表1)：VDRY2H-F與VDRY2H-R擴增VDR全長基因；KoVDR-F和VDRY2H-R引物擴增刪除特異性轉錄激活的調節功能區A/B片段的部分VDR基因，簡稱VDR-KoA/B；VDRY2H-F和KoVDR-R引物擴增刪除VDR結構域AF-2的基因片段，簡稱VDR-KoAF2；KoVDR-F和KoVDR-R引物擴增的片段同時刪除A/B和AF-2區域，簡稱VDR-KoA/B-AF2。

表1 引物信息Table 1 Primer information

注:單劃線為EcoRⅠ,雙劃線為BamHⅠ.

Note:Single underline isEcoRⅠ,Double underline isBamHⅠ.

1.2.2 VDR誘餌表達載體的構建 通過TRIZOL方法提取小鼠小腸總RNA，反轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，PCR擴增小鼠VDR基因片段。PCR擴增體系為50 μL：5 μLTaq酶緩沖液，6 μL Mg2+，5 μL dNTP，引物各2 μL，模板1 μL，Taq酶0.5 μL，水28.5 μL；PCR 反應程序：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個循環，72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。檢測并純化PCR產物和骨架載體pGBKT7，分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切并純化；在T4連接酶作用下，將VDR基因片段插入pGBKT7載體，將連接產物轉化至E.coliTop10感受態細胞，再通過菌落PCR及測序鑒定構建的誘餌表達載體，并命名為pGBKT7-VDR、pGBKT7-VDR-KoA/B、pGBKT7-VDR-KoAF2和pGBKT7-VDR-KoA/B-AF2。

1.2.3 VDR表達及自激活檢測 利用酵母一步轉化法將VDR誘餌表達載體轉化至釀酒酵母AH109，經缺色氨酸的營養缺陷型培養基(SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp)篩選重組酵母菌株；挑取單克隆菌落于5 mL SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp液體培養基，置于30 ℃恒溫搖床200 r/min培養48 h。收集菌液，將重組菌株收集，通過液氮反復凍融破除酵母細胞壁和細胞膜，再加入終濃度為工作濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液中，充分打散，置于沸水浴10 min破碎細胞后冰浴，立即置于冰上，4 ℃、10 000 r/min、冷凍離心10 min。取蛋白上清液進行12% SDS-PAGE電泳，然后轉至硝酸纖維膜，洗脫后用封閉液封閉，加入一抗，洗脫，加二抗，然后用ECL曝光試劑曝光鑒定VDR基因在釀酒酵母AH109是否成功表達。根據His與Ade作為酵母雙雜交報告基因的AH109酵母菌自身特點，篩選VDR誘餌蛋白是否具有自激活現象，將重組酵母菌株分別置于SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp液體培養基，30 ℃培養過夜，收集菌液，調整濃度至OD600=1.0，進行梯度稀釋，然后分別點樣在多種營養缺陷型培養基上，置于30 ℃培養箱，培養48 h，觀察酵母生長狀態檢測自激活現象。

1.2.4 重組誘餌酵母與小鼠cDNA文庫Y187酵母雜交 挑取沒有自激活現象的重組酵母單克隆接種到2 mL SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp液體培養基，置于30 ℃恒溫搖床200 r/min培養48 h；取500 μL菌液接種量接種至50 mL SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp液體培養基中，置于30 ℃恒溫搖床200 r/min擴大培養，檢測菌液OD600吸光值為0.5，收集菌液。將收集的菌液與含酵母小鼠胚胎cDNA文庫的酵母一起加入到2×YEPD 液體培養基中，置于30 ℃恒溫搖床30～50 r/min培養1～2 d進行酵母雜交。然后通過顯微鏡鏡檢酵母雙雜交菌，目測至一定的雜交效率后將酵母菌分別涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養基，并將菌液稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4涂布于SD/+His/+Ade/-Leu/-Trp固體培養基檢測雜交效率，置于在30 ℃培養箱中培養5～7 d。統計酵母雙雜交的雜交效率，挑取能夠在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His固體培養基上生長的酵母單克隆菌株于5 mL營養缺陷型SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His液體培養基，置于30 ℃恒溫搖床200 r/min培養48 h。提取雜交后酵母單克隆菌株質粒轉化至E.coliTop10感受態細胞中獲得大量酵母雜交后的質粒。用HindⅢ單酶切、測序鑒定，經NCBI在線比對，從而獲得可能與VDR相互作用的候選蛋白。

1.2.5 候選酵母菌株的β-半乳糖苷酶活性測定 通過ONPG的方法測定初篩克隆的β-半乳糖苷酶活性，以AH109菌株為陰性對照，酵母雙雜交后的菌株為陽性酵母菌株[10]。首先克隆酵母雙雜交菌株，挑取單克隆于2 mL SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His液體培養基，置于30 ℃恒溫搖床200 r/min培養，檢測菌液OD600的吸光值為0.8～1.0收集菌液，再用ONPG緩沖液懸浮，反復凍融之后加入ONPG(4 mg/mL)，置于37 ℃培養箱中進行反應計時，待出現黃色用1 mol/L Na2CO3終止反應，然后于常溫10 000 r/min離心2 min，轉移上清至96孔酶標板中，用酶標儀測定420 nm處吸光值OD420，β-半乳糖苷酶活性=1 000*OD420/(t*v*OD600)(t反應時間，v濃縮因子)。

2 結果與分析

2.1 VDR誘餌表達載體(pGBKT7-VDR)的構建

提取C57BL/6小鼠小腸組織總RNA，反轉錄為cDNA，以其為模板通過PCR擴增小鼠全長VDR基因，片段大小約為1 279 bp，與預期基因片段大小相一致(圖1-A)；通過雙酶切VDR基因與pGBKT7骨架載體并純化，再用T4連接酶連接后轉化至E.coliTop10感受態細胞，隨機挑取11個單克隆進行菌落PCR鑒定，其中7個單克隆中能擴增獲得大小約為1 279 bp的特異條帶(圖1-B)。最終通過測序鑒定確認，載體中VDR序列與NCBI所公布VDR基因全長序列完全一致，說明成功構建重組誘餌表達載體pGBKT7-VDR(圖2)。

A:VDR基因擴增 PCR amplification ofVDRgene；B:菌落PCR PCR assay of Colony；M.DNA標準物DL2000 DNA marker DL2000；1.陰性對照 Negative control；其他序號為試驗組 Other numbers stand for experimental group

圖1pGBKT7-VDR重組載體構建檢測
Fig.1ConstructiondetectionofrecombinantvectorpGBKT7-VDR

2.2 VDR誘餌蛋白表達檢測及自激活驗證

將成功構建的pGBKT7-VDR重組載體轉化至釀酒酵母AH109，經營養缺陷型培養基SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp篩選獲得重組酵母菌株，命名為AH109-pGBKT7-VDR(圖3)，并通過Western blot驗證VDR誘餌蛋白可在重組酵母菌株中表達。從圖4可見對照組無特異蛋白條帶，而試驗組中有一條大小約為65 ku的特異蛋白條帶，與預期結果相一致。為了排除酵母雙雜交試驗中的假陽性現象，進行VDR誘餌蛋白自激活現象的驗證，結果發現AH109-pGBKT7-VDR重組酵母菌株與陽性對照類似，可在營養缺陷型培養基上正常生長，而陰性對照菌株只能在SD/+His/+Ade/+Leu/-Trp營養缺陷型培養基正常生長(圖5和表2)。證明完整的VDR誘餌蛋白存在自激活現象，并無任何毒性。

圖2 pGBKT7-VDR重組載體示意圖Fig.2 Schematic diagram of recombinant vector pGBKT7-VDR

圖3 含重組載體的AH109菌株Fig.3 Transformants of AH109 harboring recombinant vector

圖4 Western blot檢測VDR表達Fig.4 Detection of VDR by Western blot

CK.AH109菌株 AH109 strain；PC.FGF13相互作用蛋白陽性雜交酵母菌株 FGF13 interaction protein positive hybrid yeast strain；NC.AH109-pBKT7-FGF13菌株 AH109-pBKT7-FGF13strain；1#.AH109-pGBKT7-VDR菌株 AH109-pGBKT7-VDRstrain

圖5完整VDR誘餌蛋白自激活分析
Fig.5Self-activatinganalysisofcompleteVDRbaitprotein

2.3 刪除轉錄激活域后VDR誘餌表達載體的構建及自激活驗證

為了消除自激活現象，分別構建刪除VDR轉錄激活域不同區段的誘餌表達載體，如圖6-A、6-B所示，并通過菌落PCR鑒定和測序鑒定確認成功構建刪除VDR轉錄激活域的誘餌表達載體(圖6-C、圖6-D、圖6-E)。為了檢驗刪除不同區段VDR轉錄激活域誘餌蛋白是否仍存在自激活顯現，通過營養缺陷型培養發現，試驗組2#與4#未能在SD/+Leu/-Trp/-His/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu培養基上生長(圖7和表3)，結果表明，結構域AF-2依然存在自激活現象，但切除結構域A/B未有自激活現象，同時兩者都切除也不存在自激活現象。由此證明，VDR結構域A/B導致自激活現象，而結構域AF-2未有自激活現象，于是本試驗選取pGBKT7-VDR-KoA/B載體作為誘餌蛋白表達重組載體。

表2 表達完整VDR誘餌蛋白的酵母生長活性評價Table 2 Evaluation of growth activity of yeast expressing VDR bait protein

注：CK.AH109菌株；PC.FGF13相互作用蛋白陽性雜交酵母菌株；NC.AH109-pBKT7-FGF13菌株；1#.AH109-pGBKT7-VDR菌株；“+”正常生長克隆；“-”不能正常生長克隆。

Note:CK.AH109 strain；PC.FGF13 interaction protein positive hybrid yeast strain；NC.AH109-pBKT7-FGF13 strain；1#.AH109-pGBKT7-VDRstrain;“+”Colony normal growth;“-”Colony unnormal growth.

A:重組載體示意圖 Schematic diagram of recombinant vector； A/B.不依賴配體的細胞特異性轉錄激活的調節功能區 Regulatory regions of ligand-independent cell-specific transcriptional activation；DBD.DNA結合結構域 DNA binding domain；Hinge.抗原決定區 Antigen-determining region；LBD.配體結合區 Ligand binding domain；AF-2.配體依賴激活結構域 Ligand dependent activation domain；B:PCR擴增刪除轉錄激活域VDR檢測結果 VDR assay results for PCR amplification to remove transcriptional activation domain.M.DNA標準物 DL2000 DNA marker DL2000；1.刪除VDRA/B和AF-2激活域片段 VDR-KoA/B-KoAF-2；2.刪除VDR A/B激活域片段 VDR-KoA/B；3.刪除VDR AF-2激活域片段 VDR- KoAF-2；C:菌落PCR檢測pGBKT7-VDR-KoA/B載體構建 Colony PCR assay ofpGBKT7-VDR-KoA/B；D:菌落PCR檢測pGBKT7-VDR- KoAF-2載體構建 Colony PCR assay of pGBKT7-VDR-KoAF-2；E:菌落PCR檢測pGBKT7-VDR-KoA/B-KoAF2載體構建 Colony PCR assay of pGBKT7-VDR-KoA/B-KoAF2;M.DNA標準物 DL2000 DNA marker DL2000；1.空白對照 Numbers1 stand for negative control；2～11.不同單克隆菌落PCR擴增產物 PCR production of different colonies

圖6刪除轉錄激活域后VDR誘餌表達載體的構建
Fig.6ConstructionofvariousVDRexpressionvectorsafterdeletionoftransactivationdomains

CK.AH109菌株 AH109 strain；PC.FGF13相互作用蛋白陽性雜交酵母菌株 FGF13 Positive hybrid yeast strain of interaction protein ；NC.AH109-pBKT7-FGF13菌株 AH109-pBKT7-FGF13strain；1#.AH109-pGBKT7-VDR菌株 AH109-pGBKT7-VDR strain；2#.AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B菌株 AH109-pGBKT7-VDR-KoA/Bstrain；3#.AH109-pGBKT7-VDR- KoAF2菌株 AH109-pGBKT7-VDR- KoAF2strain；4#.AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B - KoAF2菌株 AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B - KoAF2strain

圖7 不同激活域突變類型的VDR誘餌蛋白自激活分析Fig.7 Self-activation analysis of different transactivation domain mutant of VDR bait proteins

注:CK.AH109菌株；PC.FGF13相互作用蛋白陽性雜交酵母菌株；NC.AH109-pBKT7-FGF13菌株；1#.AH109-pGBKT7-VDR菌株；2#.AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B菌株；3#.AH109-pGBKT7-VDR- KoAF2菌株；4#.AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B - KoAF2菌株；“+”正常生長克隆；“-”不能正常生長克隆。

Note:CK.AH109 strain;PC.FGF13 Positive hybrid yeast strain of interaction protein；NC.AH109-pBKT7-FGF13 strain；1#.AH109-pGBKT7-VDR strain；2#.AH109-pGBKT7-VDR-KoA/Bstrain;3#.AH109-pGBKT7-VDR- KoAF2strain；4#.AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B - KoAF2strain；“+”Colony normal growth；“-”Colony unnormal growth.

2.4 酵母雙雜交效率驗證及陽性克隆篩選

將AH109-pGBKT7-VDR-KoA/B酵母菌株與含小鼠的酵母雙雜交獵物蛋白cDNA文庫的Y187酵母菌進行雜交，雜交52 h后，取少量酵母雜交菌液鏡檢，雜交成功的酵母菌株呈三葉草形狀(圖8-A)。取雜交酵母菌梯度稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4涂布于SD/+His/+Ade/-Leu/-Trp，置于30 ℃培養箱培養3～5 d，統計生長菌落數，計算雜交效率為28.75%(圖8-B)，可以用于后續試驗研究。將雜交的酵母菌液涂布于 SD/-Trp-Leu-His-Ade培養基，置于30 ℃培養箱培養6～10 d，從而獲得500多個候選陽性克隆。

2.5 候選陽性克隆鑒定分析

隨機提取50個陽性克隆質粒，經Hind Ⅲ酶切鑒定，發現不同的陽性克隆插入的基因大小也不同(圖9)。將酶切鑒定的陽性質粒測序，并在NCBI數據庫BLAST比對分析，結果篩選出12個可能與VDR互作的蛋白因子(表4)，篩選的蛋白參與不同的代謝途徑，包括細胞增殖、凋亡以及與胚胎發育、精子發育、精子活力等多種生物學功能。

A:顯微鏡檢測酵母雜交 Yeast hybrids by microscopic examination；B:酵母雙雜交效率檢測 Yeast hybridization efficiency test

圖8酵母雙雜交篩選與VDR互作蛋白
Fig.8Screeningofyeasttwo-hybridsystemandmouseVDRinteractionprotein

M.DNA標準物 5000 DNA marker 5000；其他泳道為插入不同cDNA的質粒 Other numbers are all plasmids of inserting indifferent cDNA

圖9酶切鑒定不同插入的cDNA
Fig.9IdentificationofcDNAspeciesbyenzymedigestion

2.6 β-半乳糖苷酶活性檢測

通過檢測β-半乳糖苷酶活性，鑒定所篩選的蛋白因子與VDR互作能力的強弱。結果表明：與對照組相比，所篩選的蛋白因子均有與VDR相互作用的活性，其中AKAP10、FKBP51蛋白與VDR互作能力相對較強(圖10)。最終，本研究通過驗證篩選的蛋白因子與VDR相互作用的強弱，并篩選出與雄性生殖相關的AKAP10、FKBP51以及CYP2J5蛋白因子，但是這些蛋白因子如何與VDR相互作用影響雄性生殖還需進一步驗證。

表4 BLAST分析與預測候選基因功能Table 4 BLAST analysis and predicted functions of candidate genes

圖10 酵母雙雜交菌株β-半乳糖苷酶活性測定Fig.10 Determination of beta-galactosidase activity of yeast two-hybrid strain

3 討 論

VDR作為一種親核蛋白，通過與配體特異性結合調控多種基因表達，進而影響細胞增殖分化、免疫調節、抑制腫瘤等多種生命活動[3,6,11]。VDR不僅可以直接或間接結合到一種或多種轉錄起始位點調控基因表達，VDR還能與蛋白因子互作調控生命活動。研究蛋白互作的方法主要有酵母雙雜交系統、噬菌體展示、熒光共振能量轉移、Pulldown和免疫共沉淀等方法，相對于其他技術，酵母雙雜交技術簡便、靈敏、高效以及能反映不同蛋白質之間在活細胞內的相互作用等特點[12-13]。本研究基于酵母雙雜交技術篩選與VDR互作蛋白，進一步了解VDR的作用機制。本試驗通過在釀酒酵母體內驗證VDR全長誘餌表達載體pGBKT7-VDR自激活現象，證實VDR全長基因編碼的蛋白因子可能作為轉錄因子調節某些基因的轉錄表達，與前人[3-5]研究結果一致。

本研究最終選擇刪除A/B結構域的誘餌表達載體pGBKT7-VDR-KoA/B可用于在小鼠cDNA文庫中篩選與VDR互作蛋白。通過酵母雙雜交分析獲得可能與VDR互作的12個蛋白因子。這些蛋白因子參與機體信號傳遞、細胞增殖、凋亡和生殖等多種生物學功能。A型激酶錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins,AKAPs)是一種第二信使cAMP介導的細胞信號傳遞中重要的蛋白分子家族，其主要功能是通過特異性將cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)錨定于作用底物附近，進而催化靶蛋白的磷酸化傳遞細胞信號[14-15]。AKAPs家族能錨定多種蛋白因子，并參與多種細胞信號轉導，AKAP3、AKAP 4、AKAP82等蛋白家族成員已經被報道[16-19]：它們在精子細胞和精子中表達，定位于鞭毛，這些蛋白家族分子與精子跨膜細胞信號轉導與精子的活力密切相關。AKAPs結合的KAPP3或RII-β酪氨酸磷酸化導致精子前向運動抑制和高活性運動，再通過PKA與酪氨酸磷酸化AKAPs結合而激活和補充精子活力[17]，但是AKAP10的功能幾乎沒有報道，于是可以猜測AKAP10也可以通過磷酸化或去磷酸化影響精子形成、發育和精子活力。還有一類蛋白因子FKBP家族成員調控著精子發生，它們能在睪丸組織中特異表達，在生殖細胞減數分裂Ⅰ中與其他蛋白因子形成聯會復合體，直接差異減數分裂過程的同源染色體聯會[20-21]。FKBP51是其家族一員也在睪丸中高效表達，可以通過與熱激蛋白Hsp70/ Hsp90形成復合體調節類固醇激素，其中包括糖皮質激素(GR)及孕酮激素；據報道，孕激素在某種條件下可以向雄性激素轉化，進而FKBP51可能也能調控雄性激素[22-23]。本研究通過酵母雙雜交篩選出VDR與FKBP51互作，VDR能夠調控類固醇激素維生素D代謝，進而表明：VDR與FKBP51在生命活動中有密切的關系，同時可調控雄性生殖。不僅FKBP51有這些功能，此外，FKBP51作為一種支架蛋白，參與到AKT、AKT/NFKB、PI3K/AKT信號通路，通過控制AKT磷酸化與去磷酸化，進一步調控各種生命活動[24-25]。細胞色素P450屬于CYP基因家族，廣泛存在多種組織器官，是一種由結構和功能相關的超家族酶系，有的家族成員能夠激活PI3K/AKT、MAPK等多種信號通路，形式多種生物功能[26-28]。CYP2J5便是大家族一員，在小鼠腎臟中也能調節鹽離子平衡，其表達不僅受到年齡的影響，還受到性激素的調節，即在腎臟中在雄性體內表達量高于雌性，待性成熟之后兩者表達量更為明顯[29]。除了CYP2J5參與亞油酸的代謝，還可以代謝睪酮、雙氯芬酸以及丁呋洛爾，于是CYP2J5也很有可能參與到雄性生殖通路過程[30]。