微小RNA-132和高遷移率族蛋白1在膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

張 翠

（肥城礦業(yè)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 肥城 271608）

膿毒癥是由多種因素導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，為兒科監(jiān)護(hù)室的常見(jiàn)危重癥，，病情進(jìn)展迅速，若不能盡早診斷和治療，可導(dǎo)致休克、多系統(tǒng)多器官衰竭，甚至死亡，是導(dǎo)致患兒死亡的主要因素[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）作為廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的短鏈非編碼RNA，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、器官發(fā)生、免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[2]。有研究指出miR-132參與了脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[3]。高遷移率族蛋白1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作為一種重要的促炎癥因子，在介導(dǎo)炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用[4]。本研究擬對(duì)膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并探討其與患兒預(yù)后的關(guān)聯(lián)，以期為膿毒癥機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年5月—2016年6月在山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院住院治療的膿毒癥患兒87例，其中男58例、女29例，年齡3個(gè)月～5歲，均符合兒童膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心、肝、腎等重要臟器功能不全者，以及先天性心臟病者；具有嚴(yán)重藥物過(guò)敏史、治療配合不佳者。根據(jù)患兒預(yù)后情況分為死亡組和非死亡組，其中死亡組25例（男15例，女10例），年齡（2.08±0.25）歲，非死亡組62例（男43例，女19例），年齡（2.17±0.26）歲。選取同期山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院兒保中心健康兒童50名作為對(duì)照組，其中男29例、女21例，年齡3個(gè)月～5歲。膿毒癥患兒和對(duì)照組性別、年齡等一般情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 方法

所有膿毒癥患兒于確診后進(jìn)行全身性感染相關(guān)性器官功能衰竭（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）評(píng)分。分別抽取膿毒癥患兒確診后12 h內(nèi)和對(duì)照組體檢當(dāng)日空腹靜脈血3 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管內(nèi)，通過(guò)密度梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞。將等體積的生理鹽水加入全血中進(jìn)行稀釋，取已稀釋好的血液緩慢加在淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)Sigma公司）之上，800×g離心20 min，留取中間白色環(huán)狀層液體，加入生理鹽水混合均勻，3 000×g離心10 min，棄上清，留取細(xì)胞以備檢。加入細(xì)胞裂解液裂解，利用Trizol總RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）對(duì)單個(gè)核細(xì)胞中總RNA進(jìn)行提取，并檢測(cè)總RNA純度。取1 μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈，采用LightCycler 480熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀進(jìn)行擴(kuò)增，按照熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書進(jìn)行操作。引物序列由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。miR-132引物：上游5'-GCCCGTAACAGTCTACAGCCAT-3'，下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；U6引物：上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；HMGB1引物：上游5'-ACATCCAAAATCTTGATCAGTTA-3'，下游5'-AGGACAGACTTTCAAAATG-TTT-3'；β-actin引物：上游5'-AGCGAGCATCC-CCCAAAGTT-3'，下游5'-GGGCACGAAG-GCTCATCATT-3'。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-ΔΔCt法計(jì)算外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥患兒和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較

膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.05）；死亡組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于非死亡組和對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性

表1 膿毒癥患兒和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 （±s）

表1 膿毒癥患兒和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 （±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與非死亡組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) miR-132 HMGB1 mRNA膿毒癥患兒 87 1.59±0.24* 1.63±0.11*死亡組 25 1.90±0.21*△ 1.71±0.12*△非死亡組 62 1.47±0.11* 1.59±0.09*對(duì)照組 50 1.27±0.14 1.12±0.08

Pearson相關(guān)分析顯示，膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132相對(duì)表達(dá)量與HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.521，P＜0.001）。

2.3 膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與SOFA評(píng)分的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.438，0.507，P＜0.001）。

2.4 miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平在預(yù)測(cè)患兒預(yù)后中的價(jià)值

ROC曲線分析顯示，miR-132相對(duì)表達(dá)量在預(yù)測(cè)患兒預(yù)后時(shí)，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.921，95% 可信區(qū)間（confidence interval，CI）為0.853～0.989，臨界值為1.57時(shí)，敏感性為84.0%，特異性為87.1%；HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量在預(yù)測(cè)患兒預(yù)后時(shí)，AUC為0.858，95%CI為0.769～0.947，臨界值為1.72時(shí)，敏感性為68.0%，特異性為90.3%；二者聯(lián)合檢測(cè)在預(yù)測(cè)患兒預(yù)后時(shí)，AUC為0.941，95%CI為0.878～1.000，敏感性為88.0%，特異性為91.9%。見(jiàn)圖2。

3 討論

圖2 miR-132和HMGB1表達(dá)預(yù)測(cè)患兒預(yù)后的ROC曲線

膿毒癥作為由多種因素引起的全身炎癥反應(yīng)，是兒科最常見(jiàn)的危重癥。近年來(lái)，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[6]。目前，膿毒癥具體發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚。有研究指出，膿毒癥病情進(jìn)展甚至死亡與機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂密切相關(guān)[7]。miRNA作為廣泛存在并參與機(jī)體多項(xiàng)生理功能的高度保守的短鏈RNA，可穩(wěn)定存在于機(jī)體中，但當(dāng)機(jī)體受內(nèi)、外環(huán)境影響或多種疾病早期時(shí)，其表達(dá)便可改變[8]，已成為多種疾病早期診斷及預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)[9]，對(duì)膿毒癥診斷及預(yù)后具有評(píng)估價(jià)值[10]，且miRNA參與調(diào)控了炎癥反應(yīng)及免疫過(guò)程[11]。有研究指出，miR-132在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及免疫抑制中發(fā)揮重要作用[12]。HMGB1作為廣泛存在、高度保守的DNA結(jié)合蛋白，是一種新型炎癥介質(zhì)，在介導(dǎo)炎癥所致多種損傷中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[13]。本研究分析了膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，說(shuō)明miR-132和HMGB1在膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，提示miR-132和HMGB1可能參與了膿毒癥患兒發(fā)病。

本研究結(jié)果顯示，死亡組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于非死亡組，說(shuō)明miR-132和HMGB1可能與患者預(yù)后有關(guān)。同時(shí)也從另一方面提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1表達(dá)與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)。Pearson相關(guān)分析顯示，膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132相對(duì)表達(dá)量與HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)，說(shuō)明miR-132和HMGB1可能共同參與了膿毒血癥患兒發(fā)病過(guò)程。SOFA評(píng)分是目前臨床上常用的描述器官功能不全或衰竭發(fā)展過(guò)程的指標(biāo)，是評(píng)估患者病情及預(yù)測(cè)預(yù)后的重要指標(biāo)[14]，本研究結(jié)果顯示，膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)，說(shuō)明膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平可作為評(píng)估膿毒癥患兒病情的客觀指標(biāo)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-132表達(dá)量在預(yù)測(cè)患兒預(yù)后時(shí)，AUC為0.921，敏感性為84.0%，特異性為87.1%，HMGB1 mRNA表達(dá)量則分別為0.858、68.0%和90.3%，說(shuō)明外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-132和HMGB1表達(dá)量可作為評(píng)估患兒預(yù)后的指標(biāo)，尤其是二者聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，預(yù)測(cè)的敏感性和特異性均增加，分別為88.0%和91.9%。

綜上所述，miR-132和HMGB1在膿毒癥患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)升高，且與患兒預(yù)后有關(guān)，可作為早期評(píng)估患兒預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)判斷患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后具有一定的參考意義。