2種國產化學發光檢測系統與電化學發光檢測系統檢測CA72-4的一致性評價

魏衍財，鄭維玲，石 燕，宋妙麗，葉科學，盧 旬，楊 辰

（南京醫科大學附屬蘇州醫院醫學檢驗科，江蘇 蘇州 215002）

糖類抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA72-4）作為一種較新的腫瘤標志物，對胃癌、卵巢黏液性囊腺癌和非小細胞肺癌具有相對較高的敏感性和特異性，可對這3類癌癥進行動態監測，以指導治療和預測腫瘤復發。目前，在實際工作中，由于不同檢測系統之間影響因素較多，導致CA72-4的檢測結果存在差異。2006年，衛生部辦公廳印發《衛生部辦公廳關于醫療機構間檢驗、醫學影像檢查互認有關問題的通知》要求實現檢驗結果的互認[1]。因此，評估不同檢測系統之間的差異，為實驗室間檢測結果的互認提供基礎。美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2013年8月發布了EP09-A3文件[2]，為生產廠家和臨床實驗室提供了最新的方法學比對和偏移評估方法。本研究參照EP09-A3文件，以電化學發光檢測系統為參比方法，以2種國產化學發光檢測系統為實驗方法，對3種檢測系統測定CA72-4的一致性進行了評價，為實驗室和臨床工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集南京醫科大學附屬蘇州醫院本部住院及門診患者表觀正常（無溶血、黃疸和脂血等）的新鮮血清樣本，分裝后于-80 ℃保存。共收集42份樣本，其中CA72-4濃度分布為0～6.9 U/ mL（6.9 U/mL為CA72-4生物參考區間上限）的樣本8份，6.9～50.0 U/mL的樣本24份，50.0～300.0 U/mL的樣本10份，比對數量符合CLSI EP09-A3文件要求（至少40份樣本）。

1.2 試劑與儀器

cobas e601電化學發光免疫分析儀（瑞士Roche公司），MAGLUMI 4000全自動化學發光分析儀（深圳新產業公司），CL-2000i化學發光分析儀（深圳邁瑞公司），試劑、校準品均為各儀器配套試劑。腫瘤標志物質控品（批號54601、54602）購自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 比對系統 以cobas e601電化學發光免疫分析儀及配套試劑（電化學發光法）組成的檢測系統（簡稱e601檢測系統）作為參比系統（X），以MAGLUMI 4000全自動化學發光分析儀及配套試劑（化學發光法）組成的檢測系統（簡稱MAGLUMI 4000檢測系統）作為待評系統1（Y1），以CL-2000i化學發光分析儀及配套試劑（化學發光法）組成的檢測系統（CL-2000i檢測系統）為待評系統2（Y2）。

1.3.2 樣本檢測 測定之前校準儀器，并且室內質控在控。按照EP09-A3文件要求，同時使用3種檢測系統隨機單次測定42份血清樣本，記錄CA72-4檢測結果。

1.3.3 離群值檢查 根據EP09-A3文件要求，使用廣義極端學生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法檢驗離群值。具體步驟：（1）根據42份樣本的測定結果計算[（Y-X）/X]的平均值（）和標準差（s），并根據和s計算最大偏移（ESDi）；（2）根據檢驗統計的樣本數量計算臨界值（λi）；（3）若ESD1＞λ1，則認為該觀察值為離群值，剔除后需進行第2個最大偏移的計算和比較；（4）離群值的個數通過找到最大的i，使ESDi＞λi來確定；（5）剔除離群值后，樣本數量至少40份，如不足，需補充。

1.3.4 方法比對 繪制偏差圖、散點圖、柱狀圖。根據不同分析方法間濃度差值偏差圖、百分比差值偏差圖、濃度差值排序偏差圖和百分比差值排序偏差圖所呈現的潛在特征，選擇最合適的回歸模型（OLR、WLS、Deming、Passing-Bablok）對不同比對系統的結果進行回歸擬合分析。

1.3.5 偏移估計 先進行偏移初步估計。繪制不同比對系統間差值頻數柱狀圖，并分析柱狀圖特征。如為正態分布，則使用參數檢驗（均值）估算偏移；如為非正態分布，則使用非參數檢驗（中位數）估算偏移。根據以上得到的回歸方程計算醫學決定水平處的偏移，以≤1/2偏移（±7.65%）（數據來源于2016年上海市臨床檢驗中心室間質評的平均偏移）為可接受標準。

1.4 統計學方法

采用Excel 2010、SPSS 16.0和MedCalc 9.2.0.1軟件進行統計分析。選取最合適的回歸模型計算不同比對系統的偏移，正態分布檢驗采用K-S檢驗，顯著性檢驗采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 離群值檢驗

2.1.1 目測法檢驗離群值 采用3種檢測系統測定CA72-4，繪制散點圖。結果顯示e601檢測系統（X）與MAGLUMI 4000檢測系統（Y1）的相關性良好[Y1=5.020 6+1.149 8X（r2=0.786 7）]，e601檢測系統（X）與CL-2000i檢測系統（Y2）的相關性良好[Y2=0.726 3+0.830 0X（r2=0.867 7）]。目測2個不同比對系統之間各有1個異常值。見圖1、圖2。

2.1.2 使用廣義ESD法檢驗 根據CLSI EP09-A3文件中描述的廣義ESD法進行離群值檢驗，結果顯示未發現離群值。見表1。

2.2 方法學比對與偏移評估

2.2.1 不同比對系統方法間差值潛在特征分析及最佳回歸模型選擇 參照EP09-A3文件，繪制3種檢測系統CA72-4檢測結果濃度差值偏差圖、百分比差值偏差圖、濃度差值排序偏差圖和百分比差值排序偏差圖。e601檢測系統與MAGLUMI 4000檢測系統比較，CA72-4檢測結果除低濃度波動較大外，總體變化恒定，故選擇Deming回歸模型進行擬合，見圖3。e601檢測系統與CL-2000i檢測系統比較，差值呈現混合變化，故選擇Passing-Baklok回歸模型進行擬合，見圖4。

圖1 e601檢測系統與MAGLUMI 4000檢測系統測定CA72-4的散點圖

圖2 e601檢測系統與CL-2000i檢測系統測定CA72-4的散點圖

表1 不同比對系統間離群值計算結果

2.2.2 偏移初步估計 正態分析發現，e601檢測系統（X）與MAGLUMI 4000檢測系統（Y1）差值呈非正態分布（P=0.048），圖形為非鐘形曲線[圖5（a）]，因此采用中位數作為方法間偏移估算。經計算，42份樣本百分比差值的中位數為-31.46%，大于可接受標準。e601檢測系統（X）與CL-2000i檢測系統（Y2）的差值為正態分布（P=0.548），圖形為近似鐘形曲線[圖5（b）]，因此采用均值進行方法間偏移估算。經計算，42份標本百分比差值的均值為5.94%，小于可接受標準。

2.2.3 回歸分析 根據CLSI EP09-A3文件及不同比對系統間CA72-4測定結果數值的變化特征，選取最佳回歸模型進行擬合，將CA72-4的醫學決定水平（6.9 U/mL）代入最佳回歸方程。經計算，e601檢測系統（X）與MAGLUMI 4000檢測系統（Y1）的偏移大于可接受標準，e601檢測系統（X）與CL-2000i檢測系統（Y2）的偏移小于可接受標準。見表2。

圖3 e601檢測系統和MAGLUMI 4000檢測系統測定CA72-4的偏差圖

圖4 e601檢測系統和CL-2000i檢測系統測定CA72-4的偏差圖

圖5 e601檢測系統與MAGLUMI 4000檢測系統、CL-2000i檢測系統的百分比差值頻數柱狀圖

表2 CA72-4醫學決定水平在不同比對系統回歸模型中的偏移結果

3 討論

CA72-4是目前診斷胃癌的最佳腫瘤標志物之一，具有較高的特異性，與糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）及癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）聯合檢測可以監測44.91%的胃癌。CA72-4水平與胃癌的分期有明顯的相關性，一般在胃癌的Ⅲ～Ⅳ期增高，對伴有轉移的胃癌患者，CA72-4的陽性率更遠遠高于非轉移者[3]。CA72-4特別有助于卵巢癌檢測，其與CA125及人附睪蛋白4 （human epididymis protein 4，HE4）聯合檢測，可作為診斷原發性及復發性卵巢腫瘤的生物標志物[4]。目前，臨床實驗室檢測CA72-4的方法包括放射免疫分析、酶聯免疫法、化學發光法以及電化學發光法等，尤以化學發光法和電化學發光法應用最為廣泛。但由于不同方法間CA72-4檢測結果差異較大，故有必要研究不同方法間檢測結果的一致性。

自CLSI EP09-A3文件發布以來，尚未見其在標記免疫領域的應用。EP09-A3文件可用于制造商測量程序聲明比對方法的建立、確認以及臨床實驗室新引進測量程序的方法比對驗證。EP09-A3要求比對樣本應使用未經處理的患者標本，濃度范圍覆蓋測量范圍。如需使用處理過的樣本（如混合樣本），數量應不超過總樣本數的20%。相比于EP09-A2文件[5]，EP09-A3文件作了很大修改。在比對數量方面，EP09-A2文件要求檢測至少40份樣本，按照順序雙次測定；EP09-A3文件規定至少40份樣本，可單次隨機測定，操作更加方便。在離群值判斷方面，EP09-A2文件要求通過方法內和方法間差值與規定的可接受值進行比較，檢查是否存在離群值；EP09-A3文件采用廣義ESD法判斷離群值，從單變量數據集中檢測離群值，當異常值的數量未知時，假定絕大多數數據點的分布是正態分布，經過計算及與臨界值的比較，判斷是否為離群值，該方法隨著樣本數量的增加而變得更加可靠。在選取回歸模型和偏移計算方法方面，EP09-A2文件規定方法間差值僅使用簡單的線性回歸模型進行擬合，使用分布殘差法計算平均偏移；EP09-A3文件提供了4種回歸模型，首先可利用散點圖和偏差圖進行目測分析，并以不同方法間測定結果的數據特征選擇合適的模型進行擬合，再根據回歸方程計算醫學決定水平處的偏移，數據分析更加科學。EP09-A3文件的應用更加廣泛，方案設計更加合理，可操作性更強，為臨床實驗室引進新的測量程序進行方法比對和偏移評估提供了新的依據。故本研究使用EP09-A3文件提供的比對方法作為指導。

由于e601檢測系統在本實驗室已使用較長時間，參加上海市臨床檢驗中心室間質評成績優秀，不精密度＜4%，因此將其作為參比方法，以2種國產化學發光檢測系統（MAGLUMI 4000檢測系統和CL-2000i檢測系統）作為實驗方法。由于不同廠家使用的儀器、試劑中抗體針對的被測物質抗原表位、底物不同，且無統一的溯源標準，從而導致了e601檢測系統與MAGLUMI 4000檢測系統測定CA72-4存在較大的差異，這與宋超等[6]的研究結果（4種進口全自動化學發光免疫分析系統檢測CA19-9的結果無法完全互認）一致。在實際應用中，對于不具有可比性的檢測系統，各臨床實驗室可分別建立自己的參考區間。對于CA72-4項目的允許總誤差，未查閱到相關標準，也沒有相關文獻報道，因此本研究將2016年上海市臨床檢驗中心室間質評中CA72-4項目平均偏移的1/2作為偏移的可接受標準。

總之，本研究以CLSI EP09-A3文件作為指導，將2種國產化學發光檢測系統與e601檢測系統的CA72-4測定結果進行比較，評價其一致性，為臨床實驗室選擇檢測方法提供一些參考。