兒童急性腎損傷相關新型生物標志物的研究進展

田曉怡， 沈 穎， 宋文琪

（1.國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院檢驗中心，北京 100045；2.國家兒童醫學中心首都醫科大學附屬北京兒童醫院腎內科 兒童慢性腎臟病與血液凈化北京市重點實驗室，北京 100045）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）不是一種單一的疾病，是由多種病因引起的，以腎臟功能在短時間內急速下降為主要特征，并伴有一系列嚴重并發癥的臨床綜合征。改善全球腎臟病預后組織（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）采用血清肌酐（serum creatinine，SCr）和尿量定義AKI[1]。該診斷標準不僅適用于成人患者，也在大規模兒童患者隊列中通過驗證[2]。AKI是兒童住院患者，尤其是重癥患兒常見的腎臟急重癥。兒童AKI的發病率和死亡率都很高，已成為全球關注的公共衛生問題。最新的全球AKI薈萃分析顯示，AKI的發病率在成人住院患者中高達21.6%，在兒童住院患者中高達33.7%，AKI相關的死亡率成人為23.9%，兒童為13.8%[3]。有研究結果顯示我國住院患兒中AKI發生率約為0.3%，但漏診率高達95.9%[4-5]。我國住院兒童實際的AKI發生率可能為18%左右[5]。

由于AKI病情進展迅速，死亡率高，即使存活下來的患兒大部分也可能進展為慢性腎臟疾病或需要腎臟替代治療，而且目前AKI尚無特別有效的治療方法，因此早期診斷和及時干預對于降低患兒死亡率，改善預后非常重要。傳統的腎臟疾病標志物，如肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮等不能及時反映腎臟的損傷情況，但一些新的生物標志物有助于AKI的早期診斷，可以反映不同的病理生理學機制，或許能預測疾病進展，進而為改善AKI預后提供機會。為此，文章綜述了一些重要的AKI新型生物標志物的生物學特征，及其用于國內外兒童AKI早期診斷、風險預測和預后判斷的性能，并比較了其用于AKI成人和兒童患者診斷的差異，討論了生物標志物在成人隊列中的研究為何不能直接應用于兒童；同時，對這些標志物在兒童患者中的研究存在的局限和挑戰作出分析。

1 傳統的生物標志物SCr不能及時反映腎臟損傷情況

盡管目前仍根據SCr和尿量診斷AKI，然而這2項指標與腎臟的損傷進展并不平行。Cr主要用于評估腎小球濾過率，是反映腎臟功能的指標，但不是反映腎損傷的敏感指標，特別是在腎臟發生急性損傷的情況下，SCr不會立即升高。由于腎臟的儲備能力很強，只有當腎功能損失50%時SCr才會出現明顯的升高，這就可能造成診斷和治療的延誤，而且SCr受非腎性疾病因素如年齡、性別、飲食、肌肉含量與代謝、藥物等的影響較多。因此，SCr診斷AKI的敏感性和特異性均不高，尤其對于兒童患者，不同年齡、體重者SCr基礎值不一樣，有些AKI患兒SCr峰值依然在參考區間內，這使得兒童患者比成人更易漏診。

2 新的生物標志物輔助早期診斷AKI及風險預測

AKI理想的生物標志物是比SCr更早發生改變，能更早發現微小腎損傷，能夠鑒定損傷發生部位，早期診斷AKI，輔助疾病分期，區分造成AKI的病因，能夠評估預后以及監測治療干預，可非侵襲性獲得。近年來，新發現的生物標志物，如中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL）、腎損傷分子1（kidney injury molecule-1，KIM-1）、肝型脂肪酸結合蛋白（fatty acid-binding protein，L-FABP）、白細胞介素-18（interleukin 18，IL-18）、胰島素樣生長因子結合蛋白-7（insulinlike growth factor-binding protein 7，IGFBP7）以及金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）等均有較好的診斷敏感性和特異性，在AKI成人患者和兒童患者中均有較多報道。

2.1 NGAL

NGAL是一種相對分子質量為25 000的小分子蛋白，是脂質運載蛋白超家族中的一員，共價結合于中性粒細胞明膠酶[6]。正常情況下，血清NGAL水平非常低（約為20 ng/mL），主要是來自于中性粒細胞或肝、脾和腎的少量表達。當新生兒、兒童、成人發生缺血性腎損傷或腎毒性藥物造成的腎損傷時，腎小管上皮細胞會大量表達NGAL并釋放入血漿和尿中。

大量的臨床研究結果顯示，無論是成人還是兒童患者，血和尿NGAL是手術后或膿毒血癥繼發AKI的獨立預測因素，是診斷AKI敏感且特異的早期生物標志物。HO等[7]對28項研究中尿和血漿生物標志物預測成人心臟手術相關AKI的臨床效用進行系統綜述和薈萃分析，發現術后24 h內檢測尿NGAL的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的綜合曲線下面積（area under curve，AUC）為0.72，血漿NGAL的綜合AUC為0.71，表明尿和血漿NGAL對心臟手術相關AKI具有中等預測價值。兒童AKI患者中NGAL的診斷價值與成人接近甚至更好。PARIKH等[8]對311例先天性心臟病術后兒童進行前瞻性、多中心隊列研究，發現尿NGAL與術后AKI的發生和較差的預后相關，對嚴重AKI具有中等診斷價值（AUC為0.71），而血漿NGAL與術后AKI無關。DONG等[9]追蹤檢測了150例行體外循環（cardiopulmonary bypass，CPB）術患兒尿液中6種生物標志物（NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP、TIMP-2、IGFBP7）術后2、6、12、24 h的水平，發現NGAL在CPB術后2 h即升高，6 h后其他5種標志物也升高，尿NGAL在每個時間點的診斷價值均最高（AUC＞0.9）。NGAL是目前被研究最多的AKI生物標志物。有研究結果顯示，在SCr未發生明顯變化前，AKI患兒的尿NGAL水平已升高，且在疾病進展過程中，與SCr呈正相關[10-12]；當尿NGAL的臨界值為1.36 μg/mL時，其敏感性和特異性分別為83.6%和76.2%[12]；入院后2 h，血清NGAL對AKI的早期臨床診斷也具有較好的參考價值（AUC為0.943）[10]。尿液NGAL可以用于早期預測膿毒血癥患兒繼發AKI，其AUC為0.82[13]。

2.2 KIM-1

KIM-1是相對分子質量為38 700的Ⅰ型跨膜糖蛋白，包含免疫球蛋白和黏蛋白結構域[6]，表達于腎近曲小管細胞。KIM-1最初是從缺血再灌注的大鼠腎臟細胞中發現的。正常人腎臟中KIM-1 mRNA的表達水平很低，在腎臟發生缺血損傷后急劇升高。KIM-1參與了腎損傷部位凋亡細胞、壞死細胞的清除，抑制促炎癥因子的活化[14]。

KIM-1是AKI發生24 h內的早期生物標志物。與慢性腎臟疾病和急性腎衰竭（非缺血、非造影劑造成的急性腎衰竭）患者相比，急性腎小管壞死患者在缺血發生12 h后尿KIM-1水平顯著升高[15]。SHAO等[16]對11項研究中的2 979例患者進行薈萃分析，發現尿KIM-1對嬰兒和兒童AKI患者的診斷準確性比成人患者更好，他們推測這可能是由于高血壓、糖尿病和動脈粥樣硬化等疾病在成人中患病率更高，而這些非腎性因素會影響尿KIM-1水平。因此，尿KIM-1用于診斷嬰兒或兒童AKI比成人更可靠。最新的一些病例對照研究也與上述研究結論一致。XIE等[17]的研究結果顯示尿KIM-1診斷成人AKI的AUC為0.69，敏感性為66.3%，特異性為64.7%，具有中度診斷價值。ASSADI等[18]的研究結果顯示，尿液KIM-1診斷循環衰竭患兒AKI的效能優于IL-18和NGAL，KIM-1的AUC最高為0.81[95%可信區間（confidence interval，CI） 0.76～0.93，P＜0.001]。曹曉燕等[19]發現12 h內尿液KIM-1預測足月新生兒窒息后發生AKI的AUC為0.899，敏感性為86%，特異性為87%。

2.3 L-FABP

L-FABP是脂肪酸結合蛋白家族的一員，相對分子質量為14 000。L-FABP不僅表達于肝臟，也表達于小腸、胰腺、胃、肺和腎臟[6]。人腎臟L-FABP表達于近曲小管上皮細胞。L-FABP將游離脂肪酸轉運入線粒體和過氧化物酶體代謝。當毒性過氧化物累積時，L-FABP能與其結合并外分泌入腎小管管腔內。

尿液L-FABP水平的升高早于SCr，可作為AKI的早期標志物。IVANI?EVIC′等[20]檢測了行CPB術患兒術前（0 h）及術后2、6、48 h的血清和尿液L-FABP水平，結果顯示術后發生AKI的患兒尿液L-FABP水平明顯高于未發生AKI的患兒（P＜0.05），且升高時間早于SCr，各個時間點尿液L-FABP的AUC均＞0.8，由此表明尿液L-FABP是早期診斷和預測AKI的有用的生物標志物。GREENBERG等[21]檢測了408例行CPB術的患兒的尿液NGAL、IL-18、KIM-1、L-FABP、白蛋白和胱抑素C水平，結果顯示L-FABP對CPB術后AKI的發生具有最好的預測價值，校正后的AUC為0.7。尿液L-FABP在我國兒童AKI早期診斷中的價值也有相關報道。唐榮等[22]以行CPB術的97例先天性心臟病患兒為研究對象，結果顯示AKI組術后2和6 h尿液L-FABP和NGAL水平均顯著高于非AKI組，其水平變化明顯早于SCr的升高；尿液L-FABP在CPB術后2和6 h預測AKI發生的AUC分別為0.921和0.896，尿液NGAL的AUC分別為0.908和0.928。由此可見，尿液L-FABP和NGAL在兒童心臟術后AKI早期即顯著升高，明顯早于SCr的改變，可早期預測AKI的發生。尿液L-FABP對成人AKI患者具有中度診斷價值，但略低于兒童AKI患者。DOI等[23]的研究結果顯示尿L-FABP早期診斷重癥監護病房成人患者AKI的性能優于NGAL、IL-18、N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-beta-D-glycosaminidase，NAG）和白蛋白，其AUC為0.75。成人CPB術后檢測尿L-FABP可以早期預測AKI，其AUC為0.69[24]。HO等[7]對6項關于L-FABP研究的1 700多例心臟手術后成人患者進行了薈萃分析，結果顯示尿液L-FABP預測AKI的AUC范圍為0.52～0.85，綜合AUC為0.72，預測能力為中等。

2.4 IL-18

IL-18又稱干擾素γ誘導因子，屬于IL-1超家族，能夠誘導T細胞和自然殺傷細胞產生干擾素γ，是一種促炎性細胞因子。IL-18的前體無活性，經半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1加工后變為有活性的細胞因子。AKI發生后IL-18在腎小管上皮細胞被誘導和激活，有活性的IL-18在腎小管上皮細胞高表達并釋放入尿。

目前，關于IL-18能否早期預測AKI還有爭議，在成人患者和兒童患者中結論不一致。HAASE等[25]的研究結果顯示尿液IL-18并不能鑒別出發生AKI的患者。然而，患先天性心臟病的嬰兒和兒童在CPB術后4 h尿液IL-18水平明顯升高，其早期診斷AKI的AUC為0.855[26]。DONG等[9]研究了兒童患者CPB術后不同時間點尿液IL-18的水平，結果顯示AKI組6 h后尿液IL-18水平開始升高，12 h達到峰值，其水平明顯高于非AKI組；CPB術后6 h IL-18預測AKI的AUC接近0.8。LIN等[27]對11項研究的2 796例患者（兒童患者561例、成人患者2 235例）進行了系統綜述和薈萃分析，結果顯示尿液IL-18具有中度診斷價值，預測AKI 的比值比（odds ratio，OR）為5.11，敏感性為0.51，特異性為0.79，AUC為0.77；同時還發現尿IL-18對兒童患者AKI的診斷價值高于成人患者，其OR值為7.51。

2.5 IGFBP7和TIMP-2

IGFBP7是相對分子質量為29 000的分泌蛋白，能結合和抑制胰島素生長因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）受體；TIMP-2是相對分子質量為21 000的小分子蛋白，屬于金屬蛋白酶組織抑制劑家族，可以抑制金屬蛋白酶的活性。IGFBP7和TIMP-2均為細胞周期阻滯的生物標志物。細胞周期阻滯在G1期可能是細胞避免發生DNA損傷的機制。在膿毒癥造成AKI的大鼠模型中，腎小管上皮細胞進入短暫的G1期。當細胞經歷壓力或遭受損傷時，IGFBP7和TIMP-2在腎小管上皮細胞的表達上調[28]。IGFBP7和TIMP-2是最近被發現并驗證的早期診斷AKI的生物標志物，其在成人和兒童隊列中均有研究，盡管在成人和兒童中的水平不同，但診斷價值類似。IGFBP7和TIMP-2于2013年由KASHANI等[29]首次發現。KASHANI等[29]通過大規模、多中心研究，在522例有AKI風險的成人患者血漿和尿液樣本中篩查了340種AKI病理過程中的相關分子，包括NGAL、KIM-1、L-FABP、IL-18等，發現IGFBP7和TIMP-2是最佳的生物標志物，AUC分別為0.77和0.75，并在728例危重癥患者中驗證這2個生物標志物，其乘積的AUC最大，12 h內預測中重度AKI（KDIGO 2或3期）的AUC為0.8，優于TIMP-2或IGFBP7單項檢測。LIU等[30]的薈萃分析顯示尿液TIMP-2與尿液IGFBP7的乘積是早期診斷成人AKI的可靠的生物標志物，其敏感性為83%，特異性為72%，合并ROC曲線的AUC為0.86。在嬰兒和兒童AKI患者中，TIMP-2與IGFBP7的乘積也有很好的預測和診斷價值。CPB術后2 h AKI患兒尿液TIMP-2與尿液IGFBP7的乘積開始升高，12 h后達到峰值，預測AKI的AUC為0.71[31]，術后4 h的AUC為0.85，當最佳臨界值為0.70（ng/mL）2/1 000時敏感性為83%、特異性為77%[32]。此外，尿液TIMP-2與尿液IGFBP7的乘積也可以有效預測新生兒和兒童AKI患者的不良結局（30 d和3個月的死亡率），其AUC為0.8左右[33]。因此，通過尿液TIMP-2與尿液IGFBP7的乘積可以對患者進行危險分層，預測并早期鑒別AKI高風險的患者，及時給予治療干預，改善預后。

3 AKI生物標志物新興檢測技術的敏感性和多重性

目前，臨床上常用基于酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的商品化試劑盒測定NGAL[9]、KIM-1[17]、IL-18[9]、L-FABP[9，22]。2013年，SABBISETTI等[34]建立并驗證了2種檢測尿液樣本中KIM-1的方法，一種基于磁珠ELISA，另一種基于側流免疫技術，2種方法的最低檢測限分別為12.21和190 pg/mL。隨著技術的進步，檢測儀器的自動化程度逐漸提高，設備的體積也大幅縮小。CHUNG等[35]通過磁性納米微顆粒檢測信號，可以在一個手持設備上快速檢測尿液KIM-1，便于臨床應用，且檢測最低限可達0.1 ng/mL。檢測技術的多重性也逐漸提高。ZEIDAN等[36]通過一種實時、非標記、納米增強的表面等離子體共振成像（surface plasmon resonance imaging，SPRi）技術同時超高敏感地檢測KIM和高遷移率族蛋白1（highmobility group box-1，HMGB-1）2種生物標記物，其中KIM-1檢測敏感性可達5 pg/mL。隨著質譜儀器的不斷發展，對復雜生物樣本中的蛋白質絕對定量也逐漸實現。GILQUIN等[37]建立了一種基于蛋白質標準物絕對定量法（protein standard absolute quantification，PSAQ）的靶向蛋白組學檢測方法，可以同時對尿液樣本中NGAL、L-FABP、肌-肌醇加氧酶（myoinositol oxygenase，MIOX）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PCK1）4種AKI生物標記物進行準確定量。他們建立的PSAQ兼備了多重性、高敏感性、高特異性和高準確性的特點。新興的AKI生物標記物檢測技術向著高通量、多重性、更準確和更敏感的方向發展，這對于AKI的診治有著重要意義，但這些技術離臨床廣泛應用還有一段距離，需要在實驗室進行大規模臨床樣本驗證。

4 聯合檢測AKI生物標志物的臨床價值

AKI的病理生理學過程并不完全清楚，損傷過程可能涉及免疫反應、炎癥反應等一系列復雜的細胞和分子信號通路，內皮細胞、腎小管上皮細胞、間質細胞以及許多免疫細胞均參與其中，而且病程是動態發展的，不同的生物標記物涉及AKI發展中不同的病理機制，沒有單一的生物標志物能夠準確判別AKI病程中的所有時期。因此，聯合檢測多種生物標志物可能有助于AKI的預測和診斷。許多相關研究也發現2～5個標志物聯合檢測可以提高AKI的診斷準確性[9，22，38]。DONG等[9]的研究結果顯示，CPB術后12 h聯合檢測患兒尿液NGAL、IL-18和TIMP2，可將診斷AKI的AUC從0.938提高至0.973。唐榮等[22]的研究結果顯示，術后2 及6 h尿液L-FABP及NGAL聯合檢測預測兒童CPB術后AKI發生的AUC分別為0.942和0.929。PARIKH等[38]在行心臟手術的成年患者和兒童患者隊列中評價尿液KIM-1和L-FABP單項檢測及聯合其他腎損傷標志物診斷AKI的臨床效能，結果顯示術后聯合檢測尿液KIM-1和血漿NGAL的AUC為0.76，優于單項檢測；成年患者聯合檢測尿液KIM-1、尿液IL-18和血漿NGAL的診斷價值最高（AUC為0.78），兒童患者尿液IL-18和L-FABP聯合檢測的AUC最高（0.78）。

5 AKI生物標志物對兒童患者的臨床效能

目前的研究表明AKI生物標志物在兒童患者中的診斷價值與成人類似，甚至更好；但對兒童的研究遠遠少于成人，缺乏多中心大規模的兒童隊列的驗證。兒童有其獨特的生長發育規律，隨著機體的生長發育，腎臟逐漸發育成熟，腎功能不斷完善，這些生物標志物的基線水平在兒童的不同年齡段是動態變化的。因此，AKI生物標志物在兒童患者中的臨床效能不能完全套用成人的結論，其臨床效能需在兒童隊列中進一步驗證。最近有研究報道了健康兒童尿NGAL、IL-18、KIM-1、LFABP的參考區間，從中可以發現這些標志物在兒童生長發育的不同年齡段有動態改變[39]。還有研究結果顯示，6～11歲健康兒童TIMP-2與IGFBP7的乘積高于2歲以下兒童[33]，這點和成人不同，有可能是這些AKI生物標志物在成人和兒童中診斷效能不同的原因，也部分解釋了不同的兒童患者的研究異質性較大的原因?，F有的兒童AKI患者的研究結論需要在大規模多中心的隊列中進行驗證。試驗的設計需要考慮到這些生物標志物年齡特異的基線水平，對照者也需要匹配相應的年齡段，否則有可能會導致研究結論出現偏差。建立我國健康兒童AKI生物標志物的參考區間將有助于了解與年齡相關的基線水平，對AKI患兒的診治有重大意義。

6 總結

兒童AKI的發病率高、預后差。新的AKI生物標志物的研究將為AKI的早期診斷、風險預測及療效評估帶來希望，但也需要更加嚴謹的實驗設計和更大規模隊列的研究。由于各項AKI生物標志物來源于腎臟的不同部位，單一項目的臨床效能不能滿足臨床需求，聯合檢測多種生物標志物可能有助于AKI的預測和診斷。AKI相關新型生物標志物及所處腎臟部位見表1。聯合檢測多種生物標志物時也可以嘗試非線性組合之外的其他新的算法。同時，對腎臟損傷病理過程的分子基礎學的深入研究將為AKI生物標志物的臨床解釋提供更可信的證據。

表1 AKI相關新型生物標志物以及所處腎臟部位