E-cadherin、TGF-β1和Twist1在結直腸癌變過程中的表達及意義

溫 輝 薛敬玲

(武漢大學基礎醫學院 武漢 430071)

結腸直腸癌，一種最常見的起源于上皮細胞的上皮癌，是工業化國家癌癥相關死亡率的主要原因，在西方國家結腸癌占惡性腫瘤死因的第3位[1]。在我國，據統計結直腸癌發病率為29.44/105，死亡率為14.23/105，且其發病率與死亡率呈逐步上升的趨勢[2]。Morson等研究者提出了腺瘤-癌演變學說[3]，認為結直腸癌的發生起源于腺瘤的癌變，結直腸腺瘤屬癌前期病變，上皮細胞出現異常增殖，逐漸形成腺瘤性息肉組織，最終形成惡性腫瘤組織。近年來研究發現腫瘤浸潤轉移及局部復發是導致其治療失敗和患者死亡的主要原因，上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是許多腫瘤侵襲和轉移早期的一個重要的過程[4]，其中多個轉錄因子參與 EMT 的調節。

Twist1是一種堿性螺旋狀的轉錄因子，在惡性腫瘤疾病發生發展中發揮作用，還可明顯促進腫瘤出現侵襲和轉移等病理現象[5]。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)則是具有多種生理學功能的多肽類生長因子，可有效抑制細胞生長，促進細胞間基質的形成，與腫瘤疾病發生、發展存在密切的聯系[6]。上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種鈣黏蛋白，其表達水平降低可導致上皮細胞之間的黏附能力明顯喪失、極性消失，使得腫瘤細胞遷移能力顯著性增強，最終導致腫瘤出現侵襲和轉移等[7]。本研究擬檢測E-cadherin、TGF-β1和Twist1在結直腸癌組織中的表達，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院2016年1月～2017年12月間手術切除、病理證實為結直腸癌(腺癌) 的標本70例，其中男性45例，女性25例，年齡18～80 歲，組織病理學確定病理類型、分化程度、浸潤深度、微浸潤情況及有無局部淋巴結轉移。組織分化程度:高、中、低分化分別36、20、14例；浸潤深度: 至或者穿透漿膜層的42 例，到達肌層的28 例；有局部淋巴結轉移的26 例，無轉移的44例；30 例癌旁正常組織取自距腫瘤邊緣5 cm 以上黏膜；結直腸高級別上皮內瘤變60例，結直腸低級別上皮內瘤變60例。

1.2 研究方法

采用免疫組織化學方法檢測各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達水平，將所有切除后新鮮標本固定在10%中性緩沖甲醛固定液中，取出標本，經脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后，切片，片厚3μm，測定時進行二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，3%過氧化氫浸泡10min滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液( pH 6.0±0.1)高溫修復抗原；使用一抗分別為:兔抗人TGF-β1單克隆抗體(購自武漢博士德生物技術有限公司，工作液濃度為1∶200) 、兔抗人Twist1多克隆抗體(購自上海愛必信生物技術有限公司，工作液濃度為1∶1600) 、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(購自福州邁新生物有限公司, 即用型),使用二抗是即用型免疫組化EliVision檢測試劑盒(購自福州邁新生物有限公司)。采用EnVision二步法：滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，37°C孵育30min;各步驟間均以0.01 mol /L PBS 緩沖液沖洗，嚴格按照說明控制時間和溫度;DAB顯色、蘇木素輕微襯染、脫水、透明、中性樹膠封片，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照，顯微鏡觀察。

1.3 判斷標準

E-cadherin和TGF-β1按Shimizu[8]方法對每張切片陽性細胞的著色程度進行分析，分為著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別計為0、1、2、3分，著色陽性面積按無著色、著色面積<1/3、1/3～2/3、>2/3分別計0、1、2和3分，根據著色程度和著色面積積分之和判斷最終實驗結果：≥3分為陽性，<3分為陰性，隨機選擇5個視野，取其平均值。Twist1主要表達于細胞核，根據陽性細胞數的比例將染色結果分為陽性與陰性[9]:即陽性細胞數0～10%為陰性，陽性細胞數>10%為陽性，所有切片由兩名具有豐富閱片經驗的病理醫師以雙盲法予以判讀。

1.4 統計學方法

采用SPSS16.0軟件包對全部資料予以分析處理，計數資料采用χ2檢驗，相關性采用非參數Spearman等級進行相關分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1陽性率比較

E-cadherin、TGF-β1和Twist1蛋白在不同組織中的表達結果見圖1。免疫組化結果顯示了3種蛋白在癌組織中的定位:E-cadherin在正常細胞主要定位于細胞膜，而在腫瘤細胞定位于細胞膜和細胞質， TGF-β1定位于癌細胞的細胞質中，而Twist1表達定位主要存在于癌細胞細胞核中，部分細胞質也有表達。

圖1 結直腸癌組織、高級別上皮內瘤變組織、低級別上皮內瘤變組織、癌旁組織中E-cadherin、TGF-β1和Twist1蛋白表達差異(免疫組化SP×200)

免疫組化結果顯示各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1陽性率比較均有顯著性差異(P<0.05)，且隨著結直腸癌組織、高級別上皮內瘤變組織、低級別上皮內瘤變組織、癌旁組織，E-cadherin陽性率明顯升高(P<0.05)，而TGF-β1和Twist1陽性率明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2 結直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達與臨床病理特征的關系

結直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達在分化程度、Duke分期、浸潤深度、淋巴結轉移等方面均存在顯著性差異(P<0.05)，而在性別、年齡等方面無明顯差異(P>0.05)，見表2。

2.3 結直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達之間的相關性分析

結直腸癌E-cadherin與TGF-β1、Twist1均呈負相關性關系(r=-0.632，-0.584，P<0.05)，TGF-β1與Twist1呈正相關性關系(r=0.617，P<0.05)。

表1 各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1陽性率比較(%)

組別例數Cadherin陽性率TGF-β1陽性率Twist1陽性率結直腸癌組織7042.86(30/70)85.71(60/70)80.0(56/70)高級別上皮內瘤變組織6061.67(37/60)*68.33(41/60)*63.33(38/60)*低級別上皮內瘤變組織6075.0(45/60)*#50.0(30/60)*#45.0(27/60)*#癌旁組織30 90.0(27/30)*#▲33.33(10/30)*#▲30.0(9/30)*#▲

注：*與結直腸癌組織比較，P<0.05；#癌旁組織、低級別上皮內瘤變組織與高級別上皮內瘤變組織比較，P<0.05；▲癌旁組織與低級別上皮內瘤變組織比較，P<0.05。

表2 結直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達與臨床病理特征的關系

組別例數E-cadherin陽性率(%)TGF-β1陽性率(%)Twist1陽性率(%)P值性別男4542.22(19/45)86.67(39/45)82.22(37/45)女25 44.0(11/25)84.0(21/25)76.0(19/25)P>0.05年齡≤50歲2240.91(9/22)86.36(19/22)81.82(18/22)>50歲4843.75(21/48)85.42(41/48)79.17(38/48)P>0.05分化程度高3655.56(20/36)77.78(28/36)69.44(25/36)中2040.0(8/20)90.0(18/20)85.0(17/20)低1414.29(2/14)100.0(14/14)100.0(14/14)P<0.05Duke分期A1070.0(7/10)70.0(7/10)70.0(7/10)B2850.0(14/28)82.14(23/28)71.43(20/28)C2035.0(7/20)90.0(18/20)85.0(17/20)D1214.29(2/12)100.0(12/12)100.0(12/12)P<0.05浸潤深度至或出漿膜4235.71(15/42)92.86(39/42)88.10(37/42)肌層2853.57(15/28)75.0(21/28)67.86(19/28)P<0.05淋巴結轉移有2630.77(8/26)96.16(25/26)92.31(24/26)無4450.0(22/44)79.55(35/44)72.73(32/44)P<0.05

3 討論

E-cadherin是鈣黏蛋白家族成員之一，是一類Ca依賴的糖蛋白，在上皮細胞中起著維持細胞極性及黏附力的作用，維持正常組織和器官的結構和功能，EMT過程中會出現上皮性標記物喪失，最典型就是E-cadherin蛋白的丟失，導致上皮細胞之間的黏附力喪失、極性消失，使細胞的遷移能力增強，導致侵襲和轉移[10]。Twist1為在果蠅、鼠、人等生物體內的一種堿性螺旋轉錄因子，主要表達于胎盤、胚胎中胚層和成人的某些中胚層來源的未分化組織。最近研究發現，Twist1具有癌基因的特征，能夠抑制腫瘤細胞凋亡，參與腫瘤細胞周期的調控，并通過調解腫瘤細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等參與了惡性腫瘤的發生，并且促進腫瘤侵襲轉移[11]。Valdés-Mora等[5]使用實時定量PCR技術檢測了54例結直腸癌及其癌旁正常黏膜Twist1的mRNA表達，發現結直腸癌Twist1的mRNA表達顯著高于正常黏膜組織表達, 并且其表達還與腫瘤淋巴結轉移呈顯著正相關，提示Twist1是結直腸癌演進過程中一個重要因子。TGF-β1是一類具有多種功能的多肽類生長因子，主要功能是抑制細胞生長，促進基質形成，與腫瘤發生、發展密切相關，其以自分泌或旁分泌方式產生，生物學作用多樣，能調節細胞增殖、分化、形態形成及刺激細胞外基質分泌、抑制免疫反應等[12, 13]。研究認為[1]，TGF-β1 作為 EMT 發生的一個主要誘導劑，與E-cadherin的轉錄啟動序列E-box結合，抑制E-cadherin的轉錄，通過改變細胞形態變化、上調間質細胞標記(vimentin、fibronectin)表達及下調上皮細胞標記 E-cadherin表達來誘導癌細胞發生EMT，而Twist1作為TGF-β1 信號途徑的下游信號因子，我們推測TGF-β1可能是通過轉錄激活Twist1的表達，進而發揮其對EMT標記蛋白的轉錄調節。 Fan等[14]對193 例結直腸癌患者組織進行免疫組化檢測發現，Twist1的異位表達可降低E-cadherin的表達，誘導EMT產生，從而促進癌細胞侵襲轉移能力的增強，結合前面的實驗，隨著結直腸癌組織、高級別上皮內瘤變組織、低級別上皮內瘤變組織、癌旁組織，E-cadherin陽性率明顯升高(P<0.05)，而TGF-β1和Twist1陽性率明顯降低(P<0.05)，這表明Twist1、TGF-β1 的高表達以及E-cadherin的低表達在誘導結直腸癌細胞EMT過程中發揮一定作用，這一現象的發現可為我們后期探討結直腸癌癌變的分子機制提供必要的理論基礎。

本次實驗結果我們發現結直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達在分化程度、Duke分期、浸潤深度、淋巴結轉移等方面均存在顯著性差異(P<0.05)，且結直腸癌E-cadherin與TGF-β1、Twist1均呈負相關性關系(P<0.05)，TGF-β1與Twist1呈正相關性關系(P<0.05)，這與國內外文獻報道基本一致[10,13]。綜上所述，E-cadherin、TGF-β1和Twist1三者與結直腸癌的發生發展等生物學行為密切相關，通過檢測結直腸組織E-cadherin、TGF-β1和Twist1的表達有可能為判斷結直腸癌的惡性程度及患者的預后提供線索并且有助于早期診斷結直腸癌和指導臨床治療。