真菌NBERC_170302中次生代謝產物ViridicatumtoxinA的分離純化及農藥活性

吳兆圓 張亞妮 王燕

摘要：真菌次生代謝產物一直以來都是藥物及其先導化合物的重要來源。在真菌源農藥活性天然產物的篩選過程中，得到1株具有殺菌和殺蟲活性的真菌NBERC_170302，通過活性跟蹤以及菌株大量發酵，經提取和制備高效液相色譜分離純化得到其中的活性化合物，并通過X-射線單晶衍射鑒定為Viridicatumtoxin A，進一步農藥活性測試表明，對多種農業致病真菌具有抑制作用，其中對于小麥赤霉菌、灰霉菌和小麥穎枯病菌具有明顯活性，并具有中等殺小菜蛾的活性。

關鍵詞：真菌；Viridicatumtoxin A；抗菌活性；殺蟲活性

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0056-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Secondary metabolites from fungal have always been an important source of drugs and leading compounds. In the search for pesticides of natural products from fungus， fungus NBERC_170302 with fungicidal and insecticidal activity was obtained. By active tracking and large-scale fermentation， the active compound was obtained and identified as Viridicatumtoxin A by LC-MS and X-Ray diffraction. Viridicatumtoxin A was found to show fungicidal activities to several agricultural pathogenic bacteria， and insecticidal activity to Plutella xylostella by further bioassay.

Key words： fungi； Viridicatumtoxin A； fungicidal activity； insecticidal activity

從天然產物中獲得潛在先導化合物仍然是當今藥物開發最有效的策略之一，真菌恰恰是探索發現活性天然產物的重要資源之一。自1928年Fleming從點青霉（Penicillium notatum）中首次發現抗生素青霉素以來，在不到100年的時間里，有多種真菌來源的化合物被開發成新型藥物[1]。真菌代謝產物化學結構新異，作用靶點獨特，具有廣譜、低毒、低殘留且受環境影響較小等特點，因此真菌代謝產物農藥的開發不僅對生態環境，而且對社會和經濟發展都具有重要意義。20 世紀90年代，英國捷利康公司和德國巴斯夫公司以擔子菌Strobilurus tenacellus的代謝產物Strobilurins為模型，創制了甲氧丙烯酸酯類殺菌劑[2]，它們不僅殺菌譜廣，除了對三唑類殺菌劑能防治的擔子菌、子囊菌和半知菌有明顯效果外，對卵菌引起的病害也十分有效，而且還有促進小麥增產作用[3]。另外，已有近百年歷史的植物生長調節劑赤霉素A是E. Kuiosawa 1926年從感染串珠鐮孢（Fusarium moniliform Sheldon）的水稻中分離出來的，隨后英國捷利康公司分離到赤霉酸，開發成產品。近年來，從真菌代謝產物中已經發現了很多具有開發前景的活性組分，如交鏈孢酸（Alternaric acid）在50 μg/mL濃度下對黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）和油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）抑制作用明顯，100 μg/mL濃度下抑制率可達100%，與速克靈有相似的抗菌譜[4]；日本曲霉的代謝產物黑麥酮酸F（SAF）在0.038 μg/mL濃度下就能明顯抑制雙子葉植物（洋油菜、蘿卜等）的萌發和種苗生長[5]。從盤多毛屬（Pestalotiopsis spp.）真菌中分離的一系列具有環己酮分子骨架的化合物，抑制病菌生長的最低濃度僅為6.5 μg/mL，不僅對擔子菌和子囊菌有活性，而且對卵菌有殺傷活性，殺菌譜近似于Strobilurins，具有明顯的商業開發價值[6，7]。

湖北省生物農藥工程研究中心微生物農藥資源研究室在農藥活性真菌代謝產物的篩選過程中，得到1株具有抗菌和殺蟲活性的真菌NBERC_170302，通過活性追蹤，確定了其中的目標活性化合物，通過大量發酵、提取、分離純化得到了活性化合物1（圖1），經LC-MS和X-Ray衍射鑒定為Viridicatumtoxin A，并對其農藥活性進行測試，以期為這方面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和主要試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標）、Bruker APEX DUO單晶衍射儀（銅靶衍射）（德國Bruker BioSpin公司）；Waters 2695液質聯用儀、Waters 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0）（美國Waters公司）；美國Sunfire C18 OBD制備柱（5 μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團生產。

1.2 微生物

菌株分離于長江灘涂土壤（2017年3月采樣），現菌種保存在湖北生物農藥工程研究中心，編號NBERC_170302。

1.3 菌株的培養和提取

菌株NBERC_170302的種子發酵在ISP-2培養基（麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，pH調至7.0）中，于28 ℃，以轉速120 r/min進行振搖培養。發酵96 h后，在無菌條件下將種子發酵液（10%）錐形瓶中，含大米培養基（100 g大米，加入150 mL水，高溫滅菌），在28 ℃下，靜置培養120 h。

初篩時發酵液50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機相，回收乙酸乙酯后加入1 mL甲醇溶解，作為活性跟蹤半制備樣品。大量發酵10 L的發酵液中加入10 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物0.9 g。

1.4 活性跟蹤和分離純化

活性跟蹤取800 μL初篩樣品進行半制備（Sunfire C18 OBD半制備柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL/min），洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，得到36個組分，溶劑蒸發后作為活性測試樣品。

大量發酵的乙酸乙酯提取物溶解于甲醇中，用制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5 μm，19 mm×250 mm，24 mL/min）進行粗分，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min，然后用半制備柱對化合物進行細分，采洗脫梯度5%～100%，得到化合物1（7.90 mg）。取1 mg樣品用甲醇溶解，使其結晶，作為X-Ray衍射用；另取1 mg樣品作為活性測試用。

1.5 抗菌活性測試

選取小麥赤霉菌（Fusaium graminearum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、灰霉菌（Botrytis cinema）、小麥穎枯病菌（Swptoria nodorum）、番茄早疫菌（Alternaria solani）作為試驗用病菌，菌株由湖北省生物農藥工程研究中心微生物資源研究室提供，菌種保存溫度為-70 ℃。采用半固體培養法，以標準PDB培養基為基礎，加入0.7%瓊脂配制成感染培養基，樣品以含0.05%TW-80的無菌水溶解，活性跟蹤組分樣品加5 mL去離子水后取20 μL作為生測樣品，純品初始濃度為20 mg/mL，均采用3個濃度梯度，依次對半稀釋。培養條件：溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照度3 000 lx。從第二天開始檢查并記錄活性，根據殺菌活性反應的不同，使用分級指標數（0、3、5、7、9）標記殺菌活性[8]。

1.6 殺蟲活性測試

選取豆蚜（Aphis craccivora）、小菜蛾（Plutella xylostella）及棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）作為測試對象，初孵幼蟲由本中心微生物資源研究室提供。蚜蟲活性測試采用浸液法，小菜蛾和棉鈴蟲采用人工飼料表面涂布法。活性跟蹤組分樣品中加入90 μL DMSO和4.41 mL水，混勻，取100 μL作為生測樣品，純品初始濃度為100 μg/mL，均采用3個濃度梯度，依次稀釋1倍。在樣品中接入供試幼蟲，在人工氣候室中培養，于96 h后檢查結果。活性結果采用目測分級法進行，按0、3、5、7、9分級，0表示無活性，指標為幼蟲與加入溶劑的對照組幼蟲生長狀況一致，9表示活性為100%，指標為幼蟲全部死亡，在0和9之間設置3個級別。

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

化合物1（圖1）：黃色針晶；UV（MeOH）λmax為238、285、434 nm；ESI-MS（陽離子），548.5、566.4[M+1]+；ESI-MS （陰離子），564.4[M-1]-。根據X-Ray單晶衍射結果分析，并結合文獻[9]報道，化合物1鑒定為Viridicatumtoxin A。

2.2 活性測試結果

殺菌活性和殺蟲活性評分結果見表1和表2。殺菌活性測試結果表明，化合物1對所有測試的致病菌種菌顯示有活性，其中對小麥赤霉、灰霉菌、小麥穎枯菌有明顯的抗菌活性，在5 μg/mL濃度下，活性評分大于5，尤其對于小麥赤霉菌、灰霉菌這2種致病菌，活性評分大于9（菌種未生長），分別與陽性對照嘧菌酯和咪鮮胺相當。另外，殺蟲活性測試表明，化合物1對小菜蛾具有一定的殺滅作用，其有效濃度為50 μg/mL，具有中等殺蟲活性。

3 討論

Viridicatumtoxin A是由真菌產生的一種罕見的四環素類的天然產物，其最早于1973年被當作真菌毒素從Penicillium viridicatum分離得到[10]。該化合物的絕對構型通過單晶衍射被Silverton等[11]確認。毒理試驗表明，其對小鼠（口服劑量為350 mg/kg）和大鼠（口服劑量為350 mg/kg）基本無毒[12]。活性研究表明，Viridicatumtoxin A具有良好的抗菌活性，尤其是針對臨床上的耐藥菌，如甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA），其對MRSA的抑制率比四環素高8～64倍[13]，另外，其對甲氧西林完全耐藥的超級耐藥菌也顯示具有顯著的抗菌活性[9]，表明這一化合物具有極大的研究開發價值。

本試驗通過活性跟蹤、大量發酵及分離純化，從活性菌株NBERC_170302中得到了化合物Viridicatumtoxin A，通過單晶衍射確定其結構。首次測試化合物對農業致病真菌和害蟲的活性，活性測試結果表明其對小麥赤霉菌、灰霉菌及小麥穎枯病菌均具有明顯殺菌活性，對小菜蛾具有中等的殺蟲活性。因此，可對其進行抗真菌方面的研究，為真菌源殺菌劑的開發提供良好的研究基礎。

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