水稻OsLecRK基因的亞細胞定位分析

閘雯俊 楊芳 張艷茗

摘要：凝集素類受體蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一類植物特有并分布廣泛的蛋白激酶，但水稻（Oryza sativa L.）中OsLecRK家族的亞細胞定位及其生物學功能尚未清楚。依據NCBI公布的水稻OsLecRK的ORF序列設計引物，從水稻粳稻品種葉片cDNA中擴增得到目的片段，構建OsLecRK -GFP融合瞬時表達載體，轉化水稻原生質體對其進行亞細胞定位。激光共聚焦觀察結果表明，水稻OsLecRK蛋白主要存在于細胞質，為進一步研究其功能奠定了基礎。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsLecRK；亞細胞定位

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）17-0111-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.17.028 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Lectin-like receptor kinase（LecRK） is a family of proteins which is unique and universal in plants. However， subcellular localization and biological function of OsLecRK family in rice（Oryza sativa L.） are largely unknown. OsLecRK gene was amplified from Nipponbare leaves cDNA based on the published ORF sequence on NCBI. Subcellular localization of OsLecRK protein was conducted by construction of transient expression vector OsLecRK-GFP and transformation of rice protoplasts. The confocal microscopy results showed that OsLecRK protein was located mainly in the cytoplasm， and built a good foundation for further research on the function of OsLecRK.

Key words： rice（Oryza sativa L.）； OsLecRK； subcellular localization

水稻（Oryza sativa L.）是世界的主要糧食作物之一，全球超過一半人口以水稻作為主食[1]。水稻是中國最重要的口糧作物，常年種植面積約3 000萬hm2，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻的種植安全與中國農村經濟發展和口糧安全密不可分。

凝集素類受體蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一類植物特有并分布廣泛的蛋白激酶。自1996年從擬南芥中第一次分離得到該家族成員Ath.lecRK后，人們已從多種植物中克隆到多個該類蛋白基因。研究表明，LecRK基因對植物生長發育有一定的作用。擬南芥sgc是一種LecRK基因失活的突變體，由T-DNA插入At3g53810引起，突變體sgc由花粉時期開始，所有的花粉粒都開始變形和萎縮，從而引起雄性不育[2]。LecRK基因還廣泛參與植物與生物和非生物脅迫的互作。LecRK胞外的凝集素受體結構域一直被認為是與根瘤菌的共生和病原體的抵抗相關。最近的研究也證明了這個觀點，新發現的水稻抗稻瘟病Pi-d2就是一種包含甘露糖特異的凝集素受體蛋白激酶[3]。研究人員還利用T-DNA插入和RNAi方法將擬南芥中的LecRK4.1、LecRK4.2、LecRK4.3這3個基因分別敲除掉，結果顯示任一基因的失活可增強擬南芥對萌發時ABA的應答[4]；與之相反，另一株突變體LecRK-b2在萌發時期對ABA的敏感度會降低，同時還發現LecRK-b2基因也參與發育早期對鹽壓力和滲透壓的應答[5]。

通過亞細胞定位可以了解蛋白質在細胞中的具體位置，而蛋白質的功能與其在細胞中的定位緊密相關，從而可以對基因的功能進行預測。研究蛋白亞細胞定位已有多種方法，常用的主要有融合報告基因定位法、免疫組織定位法、共分離標記酶輔助定位法等[6]，其中以綠色熒光標記GFP的應用最為廣泛[7，8]。綠色熒光標記蛋白質在藍光激發下發出綠色熒光，可以作為熒光標記與目的蛋白質融合表達并轉運到細胞特定的組織來發揮功能，通過檢測綠色熒光在細胞中的位置來獲得目的蛋白質的亞細胞定位信息。本研究通過LecRK基因的克隆和LecRK-GFP融合蛋白質的亞細胞定位，為深入研究該基因在水稻中的功能奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌Top10，由糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 水稻材料 粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp.Japonica cv.Zhonghua11）原種，由本實驗室提供，用于提取水稻原生質體。

1.1.3 植物表達載體 植物表達載體為pBWA（V）HS-gfp載體質粒。

1.2 方法

1.2.1 中花 11 cDNA的制備 采用Trizol法提取中花11葉片組織的總RNA。采用TOYOBO Rerver Tra Ace-α-TM試劑盒將提取的中花11總RNA反轉錄為cDNA。反應體系如表1所示，30 ℃，10 min；42 ℃，20 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min。將制備好的cDNA置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 亞細胞定位瞬時表達載體的構建 根據水稻LecRK基因在NCBI數據庫中序列設計引物，以中花11的cDNA為模板，擴增帶有酶切位點的LecRK的ORF全長（去除終止子）。PCR引物為LecRK F（5′-ATGGCACCTCTCCTGTTCTTGC-3′）、LecRK R（5′-TCATGCGAGTGAACTGATATAG-3′）。

采用10 μL體系進行PCR反應，各反應物濃度如表2所示。PCR 反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.0 min，重復34個循環；72 ℃延伸10 min。擴增完成后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的基因片段進行切膠回收并純化。將純化的目的基因片段連接到pMD18-T克隆載體上，轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，PCR篩選陽性克隆，提取質粒后進行測序分析。將測序結果正確的菌種進行保存并命名為pBWA（V）HS-OsLecRK-GFP。

1.2.3 水稻中花11原生質體的提取 將水稻去殼后，以70%乙醇清洗2 min，再以0.5%氯化汞清洗15 min，然后種植于1/2 MS培養基，28 ℃暗培養8～14 d。取幼苗，把根切下后浸在0.6 mol/L甘露醇中，用無菌刀片切成0.5 mm的小塊，放入10 mL酶解液[2.5% cellulase R-10（Yakult）、0.75% macerozyme R-10（Yakult）、0.6 mol/L D-甘露醇、10 mmol/L MES（pH 5.7）]，55 ℃加熱10 min，此時顏色變為深棕色，自然冷卻之后再加入0.1% BSA、10 mmol/L CaCl2，加 ddH2O至10 mL，于150 mL三角瓶中28 ℃、50 r/min避光孵育4～5 h。孵育結束后加入等體積的W5 solution[154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl和2 mmol/L MES（pH 5.7）]，輕輕搖勻使原生質體充分釋放。用150目不銹鋼細胞篩將液體過濾到干凈的培養皿中，再用電動移液器小心轉移至50 mL圓底離心管中，4 ℃、100 g吊籃離心8 min收集原生質體。余少量上清液將沉淀輕輕搖散，小心以4 mL W5 solution將原生質體重新沖洗懸浮，4 ℃、100 g吊籃離心4 min。去上清液，小心地以4 mL Mmg solution[0.4 mol/L D-甘露醇、20 mmol/L MgCl2、5 mmol/L MES（pH 5.7）]將原生質體重新沖洗懸浮，4 ℃、100 g吊籃離心4 min。去上清液，以 2 mL Mmg solution重新懸浮（此時取20 μL懸浮液進行鏡檢）。

1.2.4 水稻中花11原生質體的PEG轉化 提取的水稻原生質體冰浴30 min，23 ℃、100 g吊籃離心2 min，去上清液。用轉化數N×100 μL Mmg solution重新懸浮原生質體，以備轉化。2 mL離心管中先加入10 μL亞細胞定位載體，以及10 μL細胞核指示載體Ghd7-CFP或PXDR-OsH2A混勻，再用剪口槍頭吸取100 μL懸浮原生質體輕彈混勻，最后加入120 μL 40% PEG3350[0.4 mol/L D-甘露醇、100 mmol/L CaCl2、40%（V/V）PEG3350]輕彈混勻，室溫孵育20 min。加入500 μL W5 solution混勻終止反應，23 ℃、100 g吊籃離心2 min。去掉大部分上清液，將沉淀轉移至有1.5 mL W5 solution的12孔板中，28 ℃暗培養過夜（16 h以上）。次日將培養液轉移到2 mL離心管中23 ℃、100 g吊籃離心2 min，去掉大部分上清液，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 OsLecRK基因的克隆與亞細胞定位載體的構建

以中花11 cDNA為模板，擴增OsLecRK基因到終止密碼子前的全長ORF序列，長2 426 bp。將目的片段連接到pBWA（V）HS-GFP載體上，轉化大腸桿菌Top10，取PCR鑒定為陽性克隆的質粒（圖1）。測序結果表明，克隆序列正確，載體構建成功（圖2）。

2.2 OsLecRK蛋白質的亞細胞定位

提取轉染級別的質粒，在40% PEG3350的介導下轉入水稻原生質體，28 ℃暗培養16 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光信號。結果表明，OsLecRK蛋白質分主要布于細胞質中（圖3）。

3 小結與討論

對目的蛋白質進行亞細胞定位是一種較為直觀的研究方法，可以通過目的蛋白質在細胞中的定位情況來預測其功能。目前，被廣泛應用的能進行亞細胞定位的報告基因主要是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）。綠色熒光蛋白是細胞生物學和分子生物學研究中的一個重要工具，綠色熒光蛋白相對分子質量很小，能與多種不同的蛋白質N端或C端融合而保持其天然蛋白質的特性，因此是一種直觀性很強的遺傳標記物[9]。本研究利用融合綠色熒光蛋白及水稻原生質體瞬時表達技術對水稻OsLecRK蛋白進行了亞細胞定位。與空載相比，OsLecRK蛋白質在細胞中的分布存在差異。OsLecRK蛋白亞細胞主要定位于細胞質的結果為進一步篩選其互作蛋白，研究其功能奠定了基礎。

參考文獻：

[1] KHUSH G S.Origin，dispersal，cultivation and variation of rice[J].Plant Mol Biol，1997，35（1-2）：25-34.

[2] WAN J，PATEL A，MATHIEU M，et al. A lectin receptor-like kinase is required for pollen development in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology，2008，67（5）：469-482.

[3] CHEN X，SHANG J，CHEN D，et al.A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance[J].The Plant Journal，2006， 46（5）：794-804.

[4] XIN Z，WANG A，YANG G，et al. The Arabidopsis A4 subfamily of lectin receptor kinases negatively regulates abscisic acid response in seed germination[J].Plant Physiology，2009，149（1）：434-444.

[5] DENG K，WANG Q，ZENG J，et al. A lectin receptor kinase positively regulates ABA response during seed germination and is involved in salt and osmotic stress response[J].Journal of Plant Biology，2009，52（6）：493-500.

[6] 邢浩然，劉麗娟，劉國振.植物蛋白質的亞細胞定位研究進展[J].華北農學報，2006，21（S2）：1-6.

[7] NIEDENTHAL R，RILES L，JOHNSTON M，et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression and subcellular localization in budding yeast[J].Yeast，1996，12（8）：773-786.

[8] CHALFIE M，TU Y，EUSKIRCHEN G，et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J].Science，1994，263（5148）：802-805.

[9] 李 歡，楊皓宇，燕景洲，等.GFP在植物分子生物學研究中的應用[J].生物學雜志，2008，25（5）：55-57.