大孔樹脂分離純化敗醬草黃酮的研究

崔新梅，張海容

（忻州師范學院生化分析技術研究所，山西忻州034000）

敗醬草（patrinia），又稱澤敗、苦菜等，屬敗醬科多年生草本植物或其近緣植物的帶根全草[1]。生于山坡草地、路旁，中國各地基本均有分布，是我國常用中草藥，有清熱解毒，祛瘀排膿等多種功效[1－4]。有關提取黃酮類物質方法報道[5]：有機溶劑提取法[6]、堿性水或堿性烯醇溶液溶劑提取方法[7]、超臨界流體萃取法[8]、超聲波輔助提取法[9]、微波輔助提取法[10]等。但用這些方法提取的黃酮類物質純度不高，因此分離純化黃酮類物質成為生物醫藥迫切解決的重要路徑。目前，關于黃酮類物質分離純化的方法[11]很多，主要有柱層析法、梯度pH值萃取法、鉛鹽沉淀法、高速離心分離法、超濾法。這些方法都存在一些分離純化效果不佳、成本高、有次生危害、污染環境等問題。

大孔樹脂（macroporous resin）物理化學穩定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構成閉路循環、節省費用等諸多優點。大孔吸附樹脂的使用使中草藥有效單體成分或復方中某一單體成分的指標得到提高[12]。由于大孔樹脂其本身組成與結構特點，具有吸附性和篩選性相結合的分離，純化多種功能，已廣泛應用于化學工業、制藥和醫學衛生部門，特別適用于生物化學制品、天然產物的分離純化、藥物制備等各個領域，具有良好的應用前景。

本文研究9種大孔樹脂對敗醬草黃酮吸附和解吸性能。并考察對敗醬草黃酮的靜態、動態吸附和解吸性能及其主要影響因素，對相關的吸附動力學曲線、吸附等溫線以及動態吸附、解吸曲線等進行詳細的研究，得到適宜的敗醬草黃酮純化條件及生產黃酮化合物工藝的理論模型。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

敗醬草：產地忻州，采集于2013年6月，經忻州師范學院生物系李志英教授鑒定為敗醬科、敗醬屬多年生草本植物（Patrinia scabiosaefolia Fisch.ex Trev）干燥全株；H103、NKA、NKA－9、NKA－Ⅱ、D4006、AB－8、S－8、D4020、X－5 型大孔樹脂：南開大學生產廠；水：純凈水；95%乙醇（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；鹽酸（36%～38%）、Al（NO3）3·9H2O（分析純）：北京化工廠；氫氧化鈉、無水槲皮素（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

KQ－400KDE型高功率超聲儀：昆山市超生儀器有限公司；AB204－N型分析天平：上海澤生科技開發有限公司；L6紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；TDL－40B離心機：金壇市友聯儀器研究所；DKZ－450B電熱恒溫振蕩水槽：江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司；層析柱（Φ1.0×40）：上海精科實業有限公司；DHL－200電腦恒流泵：上海精科實業有限公司；RE－2000B旋轉蒸發儀：上海亞榮生化廠。

1.2 方法

1.2.1 敗醬草粗提取液的制備

準確稱量5.0 g的敗醬草粉末，分別加入20倍體積的40%的乙醇溶液，在60℃、時間45 min、功率100 W情況下超聲波萃取[8]。后進行抽濾，過濾2次，定容到100 mL容量瓶中備用。

1.2.2 黃酮測定及工作曲線

用移液管準確移取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL 0.1 mg/mL槲皮素標準液于10個25 mL比色管中，各加入1.0 mL 5%的Al（NO3）3溶液，用95%乙醇定容，搖勻，靜置。并繪制標準曲線。以吸光度值A為縱坐標，濃度C（μg/mL）為橫坐標，在吸收波長為510 nm處，得回歸方程：A=0.074C+0.006 9，相關系數：R2=0.999 5。

1.2.3 大孔樹脂的預處理

將10種大孔樹脂分別用95%乙醇在室溫密封下浸泡24 h，然后抽濾，用蒸餾水沖洗至流出液無醇味；用5%鹽酸浸泡3 h～4 h，然后抽濾，用蒸餾水洗至中性；再用5%氫氧化鈉溶液浸泡3 h～4 h，抽濾，用蒸餾水洗至中性后室溫晾干，備用[13]。

1.2.4 純度、回收率

純度、回收率計算按文獻[14]方法計算。

1.2.5 大孔樹脂篩選方法

9種大孔樹脂各2.0 g，分別裝入100 mL的錐形瓶中，并加入20.0 mL的敗醬草粗提取液，水浴振蕩24 h（25℃），抽濾，離心，測定溶液中剩余黃酮濃度C1（mg/mL）。式中：C0為吸附前敗醬草粗提取液黃酮濃度，mg/mL；V為吸附溶液體積，mL；m為樹脂質量，g。根據公式（1）、（2）計算吸附量 Q（mg/g）和吸附率（%）。同理，將中充分吸附24 h的樹脂，用少量蒸餾水洗滌，轉移到100 mL錐形瓶中，加入95%的乙醇20.0 mL，置于恒溫水浴振蕩器中，振蕩24 h（25℃），測定吸附液中黃酮的濃度C2（mg/mL）。根據公式（3）計算解吸率（%）。

1.2.6 大孔樹脂純化敗醬草黃酮優化設計

在考察單因素試驗基礎上，選擇影響大孔樹脂純化敗醬草黃酮的幾個主要因素：吸附速率、洗脫速率、pH值、乙醇體積分數（洗脫液）按表1設計進行正交試驗。

表1 大孔樹脂純化敗醬草黃酮工藝正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for purification of flavonoids from patrinia with macroporous resin

2 結果與討論

2.1 大孔樹脂篩選

用 H103、NKA、NKA-9、NKA-Ⅱ、D4006、AB-8、S-8、D4020、X-5這9種預處理過的樹脂，進行敗醬草黃酮的靜態吸附試驗[14]。在相同試驗條件下，測得各樹脂對敗醬草黃酮的靜態吸附、解吸結果如表2所示。

表2 不同類型樹脂對敗醬草黃酮的吸附、解吸情況比較Table 2 Comparison of adsorption and desorption of different types of resin to patrinia flavonoids

由表2可見在這9種樹脂中對敗醬草黃酮吸附量和吸附率最大的是S-8樹脂，吸附量是1.112 mg/g，吸附率是95.91%；其次是AB-8和H103樹脂，吸附量分別是1.069 mg/g和0.812 mg/g，吸附率分別是87.69%和66.62%；NKA-Ⅱ樹脂對敗醬草黃酮吸附量和吸附率最小。

從樹脂方面看，樹脂的骨架結構、極性（功能基）、比表面積和平均孔徑是影響樹脂吸附的重要參數[15-16]。在樹脂吸附過程中，極性稍強的樹脂對極性強的分子有較強的吸附作用，試驗中的敗醬草黃酮因具有酚羥基而具有極性，S-8樹脂屬極性樹脂，故S-8對敗醬草黃酮的吸附性能相對較好。從表1可以看出，靜態吸附較好的樹脂中除S-8外，95%的乙醇都能很好的洗脫AB-8和H103樹脂上吸附的敗醬草黃酮。雖然S-8樹脂的吸附能力強，但其洗脫率太低，終選用AB-8樹脂吸附分離敗醬草黃酮。

2.2 泄露曲線

將300 mL敗醬草粗提液以1.0 mL/min的流速進樣，加入AB-8樹脂柱中，以1mL/min的流速通過，分段收集流出液，測定并計算每段流出液的黃酮的濃度，動態泄露曲線如圖1所示。

圖1 AB-8樹脂吸附敗醬草黃酮泄露曲線Fig.1 Leak curve of AB-8 resin adsorption patrinia flavanoids

從圖1可以看出，隨進樣液體積增加，流出液中黃酮含量的增加，當進樣量體積達到210 mL后，流出液中黃酮含量與進樣液中含量基本保持不變，此時樹脂的吸附量已經達到飽和。用AB-8樹脂吸附敗醬草黃酮選擇最大進樣量為210 mL。

2.3 上樣速率考察

取5份的粗提取液，分別加入5根AB-8樹脂柱中，以 0.5、1.0、1.5、3、4.5 mL/min 的流速通過，收集各自流出液，測定并計算黃酮吸附量，結果見圖2。

圖2 流速對AB-8吸附敗醬草黃酮影響Fig.2 Effect of flow rate on AB-8 adsorption patrinia flavonoids

由圖2可以看出，5種流速叢0.5 mL/min已經有較好的吸附效果。這是因為上柱流速過快，敗醬草黃酮溶液跟樹脂平衡的時間短，黃酮分子來不及擴散到樹脂的內表面從而導致瀉漏過，使得黃酮吸附降低。流速慢，黃酮分子有充足的時間與樹脂的內表面接觸，增加對黃酮的吸附，從而提高吸附情況。考慮實際操作效率，選擇上樣流速為1.0 mL/min。

2.4 乙醇體積分數對靜態解吸的影響

試驗采用乙醇作為洗脫劑，主要是考慮到敗醬草黃酮易溶于乙醇，且乙醇毒性小，適合天然藥物有效成分的提取分離。選用20%、40%、60%、80%、95%這5種不同濃度的乙醇洗脫劑，比較解吸率，結果如表3所示。

表3 乙醇濃度對敗醬草黃酮洗脫解吸率的影響Table 3 Effect of ethanol concentration on the elution desorption rate of patrinia flavonoids

隨著乙醇濃度從20%到60%的增加，敗醬草黃酮解吸率也增大；乙醇濃度超過60%時，敗醬草黃酮解吸率反而減小，故選擇60%的乙醇洗脫敗醬草黃酮較適宜。

2.5 洗脫液pH值對解吸的影響

用60%乙醇溶液洗脫，洗脫速率為1.0 mL/min，用三酸緩沖液調節 pH值分別為 2.15、3.30、4.56、6.14、7.50、9.01、11.2，收集洗脫液，計算洗脫率分別為 35.2%、72.4%、74.9%、75.3%、76.8%、58.0%、43.1%。試驗表明，pH值對洗脫率影響較大，在酸性范圍內，敗醬草黃酮洗脫率較高，pH值增大（pH﹥7.50）洗脫率隨pH值增大而顯著下降。上述情況與文獻報道[17]一致，即黃酮類物質的酚羥基，在酸性條件下以分子狀態存在，主要以范德華力與樹脂吸附作用；溶液pH值增大為堿性時，酚羥基離子化，與樹脂間的分子間力下降，因此選pH 7.50。

2.6 洗脫速率的影響

取4份50mL的敗醬草粗提取液，分別加入4根填充AB-8樹脂柱，在pH 6.14條件下，分別用0.5、1.0、2.5、4.5 mL/min進行洗脫，收集各自流出液，考察洗脫速率對洗脫效果的影響，結果見圖3。

圖3 洗脫速率對解吸率的影響Fig.3 Effect of elution rate on desorption rate

由圖3可得，洗脫速率對洗脫效果有明顯影響。洗脫速率與對解吸率兩者成反比關系。流速1.0 mL/min時，解吸率最高。隨著解吸速率的增加，解吸率呈下降趨勢。結果表明，在進行解吸試驗時，速度越慢解吸效果越好，可能是因為流速太快，洗脫劑未能與被吸附的黃酮進行充分作用而將其從大孔樹脂的吸附位點上置換出。但流速過低，洗脫時間較長，考慮生產成本與效率，選擇1.0 mL/min作為洗脫速率。

2.7 洗脫劑用量考察

取敗醬草黃酮粗提取液，加入AB-8樹脂柱中，以1.0 mL/min的流速通過，待樹脂達到平衡后，用60%的乙醇溶液1.0 mL/min進行洗脫，分段收集，每段收集10 mL，測定流出液黃酮濃度，繪制洗脫曲線，見圖4。

圖4 AB-8樹脂吸附敗醬草黃酮洗脫曲線Fig.4 Elution curve of AB-8 resin adsorption patrinia flavonoids

由圖4可知，采用體積分數60%的乙醇溶液，流速1.0 mL/min進行洗脫，洗脫單一、尖銳、對稱，沒有拖尾現象。表明80 mL的80%乙醇溶液基本已經完全可以將敗醬草黃酮完全洗脫下來，在20 mL時的解吸率最大為72.94%。

2.8 大孔樹脂純化敗醬草黃酮正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇影響大孔樹脂純化敗醬草黃酮的幾個主要因素：吸附速率、洗脫速率、pH、乙醇體積分數（洗脫液）按表1設計進行正交試驗，試驗結果見表4。

試驗因素的影響大小為：洗脫速率/mL（B）>吸附速率/mL（A）>乙醇體積分數/%（D）>pH 值（C），最優工藝為：B2A2D3C3，即，洗脫速率 1.0mL，吸附速率 1.0mL，乙醇體積分數80%，pH值為7.5。

表4 大孔樹脂純化敗醬草黃酮正交試驗結果L9（34）Table 4Results of orthogonal test of L9（34）for flavonoids purified from patrinia with porous resin

2.9 工藝驗證

AB-8樹脂最佳工藝驗證，為驗證所選樹脂的可行性，按照已選的最佳工藝條件：用AB-8樹脂吸附敗醬草黃酮提取液中黃酮時的最佳動態吸附條件：在室溫25℃，吸附速率為1.0 mL/min；洗脫過程，洗脫速率為1.0 mL/min，pH 7.5，洗脫液為80%的乙醇水溶液、用量為80 mL。進行3次平行試驗，可得敗醬草黃酮回收率為89.6%（RSD=2.03%），純度達57.31%，結果表明在上述工藝條件下，AB-8樹脂對敗醬草黃酮吸附量大、洗脫率較高，且工藝的穩定性良好，可作為工業生產的參考工藝。

3 結論

本試驗采用大孔吸附樹脂法從敗醬草提取液中分離黃酮類化合物。通過靜態吸附法對AB-8、NKA、NKA-9、NKA-Ⅱ、D4006、H103、S-8、D4020、X-5 這 9種大孔樹脂進行篩選，選出AB-8型樹脂吸附敗醬草中黃酮效果最佳。通過正交試驗得出的最佳試驗條件下，敗醬草黃酮回收率為89.6%（RSD=2.03%），經AB-8型樹脂吸附敗醬草中黃酮純度由粗提液11.20%達57.31%，提高近5倍。因此，AB-8型大孔樹脂適合敗醬草中黃酮類物質的分離純化。