酶法制備玉米芯阿魏酰低聚糖的工藝條件優化

孫元琳，白宇仁，王曉聞，周素梅

（1.運城學院生命科學系，山西運城044000；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；3.中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193）

玉米芯是玉米加工產業的重要副產物之一。玉米芯作為一種農業廢棄物，曾經絕大多被燒掉或簡單處理當做動物飼料食用，造成很大程度的資源浪費[1]。玉米芯不溶性膳食纖維含量較高，主要為阿拉伯木聚糖[2]。此外，玉米芯中還含有豐富的酚酸類物質。Torre P等[3]研究表明，玉米芯中含有的酚酸物質主要是阿魏酸和對香豆酸。玉米芯中的阿魏酸含量（1.4%）高于麥麩（0.4%～0.7%）、蔗渣（1%）、小麥秸稈（1.2%）等，是大多數農業副產品中最有潛力的阿魏酸資源[4]。

阿魏酰低聚糖（feruloylated oligosaccharides，FOs）又稱為阿魏酸糖酯，低聚糖阿魏酸酯，由結合態阿魏酸與糖羥基通過酯鍵連接而成，具有抗氧化、抗衰老、促進益生菌增殖、增強機體免疫功能等生理活性[5]。目前，通過對禾本科植物不溶性膳食纖維進行可控性酶解，可以獲得阿魏酰低聚糖。Smith M M等[6]最早采用纖維素酶處理小麥麥麩得到阿魏酰低聚糖。胡楠楠等[7]采用木聚糖酶水解米糠制備出阿魏酰低聚糖。而關于從玉米芯中制備阿魏酰低聚糖卻鮮有報道。本試驗旨在通過生物酶法制備玉米芯阿魏酰低聚糖，并結合響應面分析探討其最佳工藝條件，為玉米資源的綜合利用和有效增值提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

玉米芯：市售；木聚糖酶（2.5 U/mg）：諾維信（中國）生物技術有限公司；木糖標準品（xylose，Xyl）：美國Sigma公司；低聚木糖標準品（xylooligosaccharide，XOS）：山東龍力生物科技股份有限公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活≥4 U/mg）、中性蛋白酶（酶活≥60 U/mg）、糖化酶（酶活≥100 U/mg）：北京奧博星生物技術有限責任公司；3-（N-瑪琳代）丙磺酸[3-（N-Malin substituted）propane sulfonic acid，MOPS]、二苯胺、冰乙酸、乙酸乙酯、丙酮、氨水均為分析純。

RE-52A型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；Cary5000紫外-可見-近紅外分光光度計：美國安捷倫（Agilent）公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器：江蘇榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米芯阿魏酰低聚糖酶法制備工藝流程

玉米芯→粉碎過篩→高壓蒸汽處理（121℃，45min）→依次加入耐高溫α-淀粉酶，糖化酶和蛋白酶（調節相應的pH值和溫度）酶水解→攪拌→高溫滅酶（100℃，10 min）→離心（3 000 r/min，15 min）→取沉淀物→蒸餾水洗滌→無水乙醇洗滌→真空干燥（45℃）→玉米芯不溶性膳食纖維。

玉米芯不溶性膳食纖維→加入醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和木聚糖酶→酶解→滅酶（100℃，10 min）→離心（3 000 r/min，15 min）→取上清液→抽濾→濃縮→阿魏酰低聚糖酶解液。

1.2.2 酶解液FOs含量測定

取酶解液0.5mL，與4.5mLMOPS緩沖液（100mmol/L，pH6.0）充分混合，分別在286 nm和325 nm波長處測定酶解液的吸光度值（A286和A325），按下式計算酶解液中阿魏酰低聚糖含量[8]。

式中：ε286=141 76 L/（mol·cm），ε325=103 50 L/（mol·cm），ε′286=124 65L/（mol·cm），ε′325=19345L/（mol·cm）。

1.2.3 薄層層析

精確吸取6 μL標準樣液（1%木糖、1%低聚木糖）和酶解液點于GF254硅膠板上，放入層析缸中進行展開，展開劑為乙酸乙酯∶甲醇∶蒸餾水∶氨水=5∶9∶1∶1.5（體積比）。展開結束后，用噴霧器朝薄層板上均勻噴灑苯胺-二苯胺-磷酸-丙酮試劑，105℃條件下顯色10 min[9]。通過觀察標準品與酶解液的斑點顏色和位置，對酶解液中低聚糖聚合度進行分析。

1.2.4 單因素試驗與響應面優化試驗

設定底物濃度50 g/L、酶解時間18 h、pH5.0、酶解溫度 50℃，加酶量分別控制為 21.4、42.8、64.2、85.6、107、128.4 mg/L；設定木聚糖酶添加量 85.6 mg/L、pH5.0、酶解溫度50℃、底物濃度50 g/L，酶解時間分別控制為 6、9、12、15、18、21 h；設定木聚糖酶添加量85.6 mg/L、pH5.0、酶解溫度 50℃、酶解時間 18 h，底物濃度分別控制為 30、50、70、90、110、130 g/L；設定木聚糖酶添加量85.6 mg/L、底物濃度50 g/L、pH5.0、酶解時間 18 h，酶解溫度分別控制為 35、40、45、50、55、60 ℃；設定木聚糖酶添加量85.6 mg/L、底物濃度50 g/L、酶解時間18 h、酶解溫度50℃，pH值分別控制為3、3.5、4、4.5、5、5.5。

根據單因素試驗結果，以加酶量、酶解時間、底物濃度、酶解溫度、pH值為試驗因素，并以-1、0、1為自變量的低、中、高水平，以FOs含量為響應值，設計五因素三水平試驗。因素與水平設計如表1所示。

1.3 數據分析方法

各指標均做3次重復，運用Excel軟件對試驗數據進行處理，采用SigmaPlot10.0軟件進行繪圖，響應面分析由Design Expert 8.0.6軟件完成。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Factor and level used in response surface methodology

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 木聚糖酶添加量對FOs含量的影響

木聚糖酶添加量對FOs含量的影響見圖1、圖2。

圖1 木聚糖酶添加量對FOs含量的影響Fig.1 Effects of xylanse amount on the production of FOs

圖2 不同木聚糖酶添加量酶解液的薄層層析圖Fig.2 TLC of enzymatic hydrolysate of different xylanase amount

從圖1可以看出，隨著反應體系中木聚糖酶添加量的增大，FOs的含量呈現上升趨勢，當酶量達到85.6 mg/L，FOs的含量增長緩慢。原因在于，當底物濃度不變的情況下，FOs的含量會隨著木聚糖酶添加量的增加而增加，但是，較高的酶添加量會造成酶的浪費損失和反應過度導致阿魏酰低聚糖的分解。當酶添加量達到一定程度后，阿魏酰低聚糖的溶出達到平衡狀態，再增加酶量，底物已經充分反應而不利于阿魏酰低聚糖的溶出。結合薄層層析圖來看，隨著酶量的增加，薄板的顏色逐漸加深，說明酶解液中FOs含量逐漸升高。加酶量85.6 mg/L時薄板上出現了明顯的木糖組分但顏色較淺。加酶量107 mg/L、128.4 mg/L木糖組分顏色較深，說明其中木糖含量高、酶解過度。結合FOs含量變化和酶解液中低聚糖聚合度，同時考慮節約成本，選取的加酶量進一步優化的范圍為64.2 mg/L～107 mg/L。

2.1.2 底物濃度對FOs含量的影響

底物濃度對FOs含量的影響見圖3。

圖3 底物濃度對FOs含量的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on the production of FOs

從圖3可以看出，隨著反應體系中底物濃度的增加，FOs的含量呈現先上升后下降的趨勢。原因在于，隨著底物濃度的升高，底物中可被利用的阿拉伯木聚糖含量升高，酶與底物可以充分接觸反應，使反應體系中FOs大量溶出；但當底物添加量超過一定限度時，反應體系會變得非常黏稠，酶與底物結合受限甚至底物會抑制酶的部分活性，底物中阿拉伯木聚糖不能充分水解，故FOs的含量降低[10]。由此初步確定酶法制備FOs的優化范圍為90 g/L～130 g/L。

2.1.3 酶解時間對FOs含量的影響

酶解時間對FOs含量的影響見圖4。

圖4 酶解時間對FOs含量的影響Fig.4 Effects of time on the production of FOs

由圖4可知，隨著酶解時間的進行，FOs含量呈現先上升后下降的趨勢。原因在于，酶與底物充分反應需要一定的時間，達到最適時間時，FOs含量達到最高值0.252 5 mmol/L。超過最適時間后，FOs會進一步分解產生木糖，導致FOs含量下降。故確定酶法制備FOs的進一步優化范圍為12 h～18 h。

2.1.4 pH值對FOs含量的影響

pH值對FOs含量的影響見圖5。

每種酶都有其最適宜的pH值，在最佳pH值條件下，酶與底物可以充分反應結合，此時酶活力最高[11]。在非最佳pH值條件下，酶活性會降低甚至失活，相應的FOs含量也會降低。如圖5所示，在pH3.5條件下，FOs含量最高，說明木聚糖酶在pH3.5時活力最強，條件最適宜。由此，確定進一步優化的范圍為pH3～4。

2.1.5 酶解溫度對FOs含量的影響

酶解溫度對FOs含量的影響見圖6。

圖6 酶解溫度對FOs含量的影響Fig.6 Effects of temperature on the production of FOs

從圖6可以看出，當酶解溫度小于55℃時，隨著溫度的升高，FOs的含量上升，55℃以后，隨著溫度的上升，FOs的含量降低。原因在于溫度升高，分子熱運動速度會加快，滲透、溶解、擴散速度相應提高，酶與底物可以充分接觸，故FOs含量升高[12]。但在酶解反應過程中，酶存在最適溫度，當超過其最適溫度時，酶活性會降低甚至喪失，使FOs的含量降低。由此，確定進一步優化的溫度范圍為50℃～60℃。

2.2 響應面試驗分析

在上述單因素試驗的基礎上，利用Box－Behnken程序分別考察影響玉米芯阿魏酰低聚糖酶解工藝的5個主要因素，即加酶量（A）、酶解時間（B）、底物濃度（C）、pH值（D）、酶解溫度（E），設計五因素三水平響應面優化試驗。以阿魏酰低聚糖含量為響應值，利用Design－Expert8.0.6軟件進行優化分析，試實驗設計與結果見表2，方差分析見表3，各響應面結果見圖7（不顯著圖略）。

表2 響應面分析試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments

續表2 響應面分析試驗設計與結果Continue table 2 Design and results of response surface experiments

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

對表2試驗結果進行多元回歸擬合，得到A（木聚糖酶添加量）、B（酶解時間）、C（底物濃度）、D（pH）、E（酶解溫度）多項回歸方程為

圖7 以阿魏酰低聚糖含量為指標的響應面圖Fig.7 Response surface plots on the production of FOs

由表3可知回歸模型極顯著（P＜0.000 1），而模型失擬項不顯著（P＞0.05），表明模型選擇合適。同時，該回歸模型系數R2和調整R2分別是0.990 8和0.983 5，說明該模型的擬合程度較好，因此利用該模型預測玉米芯阿魏酰低聚糖酶解工藝是切實可行的。由顯著性和F值可知，玉米芯阿魏酰低聚糖酶解工藝的影響因素主次順序為酶解溫度>酶解時間>pH值>加酶量>底物濃度。

響應面曲線梯度反映各因素對阿魏酰低聚糖含量的影響大小，曲線越陡表明該因素對阿魏酰低聚糖含量影響越大。由圖7可知，加酶量和底物濃度、加酶量和pH值、pH值和酶解溫度之間都存在顯著的交互作用（P<0.05）。其中，pH值和酶解溫度交互最為顯著，隨著這兩個因素的增大FOs含量有明顯的增加。這與表3回歸分析結果相符。

運用響應面Design Expert 8.0.6軟件，結合回歸模型和響應面圖分析得到玉米芯阿魏酰低聚糖最佳酶解工藝條件為：加酶量89.64 mg/L、酶解時間16.41 h、底物濃度111.40 g/L、pH3.65、酶解溫度53.09℃，預測玉米芯阿魏酰低聚糖的含量為0.771 54 mmol/L。根據實際情況調整為加酶量89.7 mg/L、酶解時間16 h、底物濃度111 g/L、pH3.65、酶解溫度53℃，得到玉米芯阿魏酰低聚糖的含量為0.764 8 mmol/L，與預測值的相對誤差為0.87%，表明在該試驗模型下得到的最佳工藝條件具有較高的可靠性。

3 結論

通過單因素試驗和響應面優化試驗，得到酶法制備玉米芯阿魏酰低聚糖的最佳工藝條件為：加酶量89.7 mg/L、酶解時間 16 h、底物濃度 111 g/L、pH3.65、酶解溫度53℃。在此優化條件下FOs的含量可達到0.764 8 mmol/L。