萬壽菊油揮發性成分的GC-MS保留指數定性分析

董世良，陳一，劉冰，馬舒翼，肜霖，尹團章，曹林海，吳昭，趙國豪，*

（1.湖北中煙工業有限責任公司，湖北武漢430040；2.鄭州輕工業學院，河南鄭州450000）

萬壽菊（Tagetes Erecta L.），又名臭芙蓉，為菊科、萬壽菊屬，一年生草本植物，管狀花花冠黃色，原產于墨西哥。中國各地均有分布。萬壽菊油作為食品香料，主要應用于糖果、飲料、調味品等食品中[1]，可經水蒸氣蒸餾法[1]、同時蒸餾－萃取法[2]，微波輔助萃取法[3]等方式由其莖葉或花中獲取。目前國內報道的萬壽菊油揮發性成分分析方法[1－3]大多采用氣相色譜－質譜聯用技術（gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS）檢測，再根據譜庫檢索定性化合物，難以準確區分萬壽菊油中存在的同分異構體化合物，無法為制定萬壽菊油產品質量標準提供依據。

保留指數定性則可在無標樣時利用文獻中的保留指數定性，方法誤差可小于1%。該方法已廣泛應用于中藥、精油等樣本的揮發性成分的定性分析[4－7]。本文引入保留指數輔助定性方法，采用保留指數結合質譜標準譜庫檢索（National Institute of Standards and Technology，NIST）的方式對萬壽菊油揮發性成分進行分析和定性，進一步為萬壽菊油作用效果研究和質量控制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬壽菊油：深圳波頓香料有限公司；無水乙醇、無水硫酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司；正構烷烴混合對照品 C8－C40：美國 Sigma－Aidrich 公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6890A/5973N氣相色譜－質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取萬壽菊油0.1 g，用無水乙醇將其稀釋100倍，再加入無水硫酸鈉進行干燥，進樣前采用0.45 μm有機相濾膜過濾。

1.3.2 GC－MS的分析條件

色譜條件：毛細管柱DB－5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為 He；恒流模式，體積流量 1 mL/min；進樣量1 μL；分流進樣，分流比10∶1；進樣口溫度為220℃；升溫程序為初始溫度40℃，保持1 min，以3℃/min的速率升溫至280℃，保持5 min；溶劑延遲時間為4 min。

質譜條件：傳輸線溫度為240℃；離子源為EI源；電子能量為70 eV；離子源溫度：250℃；全掃描范圍（m/z）：40～550。

1.4 保留指數（KI）的計算

按照上述1.3.2的條件對正構烷烴混合對照品C8－C40進行GC－MS分析，記錄各正構烷烴保留時間，根據線性升溫公式計算各組分的KI，KI=100n+

式中：tx為被分析組分流出峰的保留時間，min；tn和tn+1為碳原子數為n和n+1的正烷烴流出峰的保留時間，min，且 tn

2 結果與分析

2.1 萬壽菊油揮發性成分分析

采用GC－MS分析萬壽菊油揮發性成分，其GC/MS譜圖見圖1。

由圖1可知，萬壽菊油揮發性香氣成分氣質譜圖中色譜峰眾多，化學組分復雜，采用峰面積歸一化法計算圖1中萬壽菊油揮發性香氣中各組分的峰面積相對質量分數，然后選取相對質量分數大于0.1%的化學成分進行分析。選取各色譜峰質譜匹配度高的可能物質，通過文獻檢索其KI*值并與計算所得的該色譜峰KI值相比較，以檢索所得KI*值和計算所得KI值相似度最高的化合物為最適合的檢索結果，具體結果見表1。

由圖1和表1可知，本試驗通過GC－MS分析從萬壽菊油中共檢出50個組分，采用保留指數和質譜標準譜庫檢索相結合的雙重定性的方法從萬壽菊油中共鑒定出39種主要成分，占其揮發性成分總量的97．99%，其主要組分中含量較高的組分為：當歸酸－3－甲基戊酯（12.58%）、異丁酸異戊酯（11.08%）、（1S）－（－）－α 蒎烯（10.91%）、丁酸異丁酯（10.38%）、（Z）－2－甲基－2丁烯酸2－甲基－丙酯（9.95%）以及異丁酸－4甲基戊酯（7.79%）。

圖1 萬壽菊油揮發性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of volatile compound in extracted oil of Tagetes Erecta L.flowers

表1 萬壽菊油揮發性成分的鑒定結果Table 1 Results of compounds in extracted oil of Tagetes Erecta L.flowers

續表1 萬壽菊油揮發性成分的鑒定結果Continue table 1 Results of compounds in extracted oil of Tagetes Erecta L.flowers

2.2 保留指數在萬壽菊油揮發性組分定性研究中的應用

本文經質譜標準譜庫檢索（NIST）后，利用保留指數進行輔助定性，縮小了檢索范圍，能夠提高天然化合物定性的準確性，盡量減少誤判和錯判。對檢索出的39個化合物進行定性分析時，發現許多酮類、酯類、醇類等化合物，若僅用質譜庫檢索定性會難以判定甚至誤判，尤其是同系物和同分異構體的確定。保留指數在萬壽菊油揮發性成分鑒定中的應用實例見表2。

如表2所示，本試驗中保留時間為15.97 min的位置存在一個色譜峰，通過GC-MS的NIST標準譜庫檢索分析，獲得4個相似度較高的化合物，按匹配度高低排序排為異丁酸-2-甲基丁酯（925）、丁酸異戊酯（903）、異丁酸異戊酯（897）和丁酸戊酯（886），經比對保留指數文獻可知，上述4種酯的保留指數分別為1 016、1008、1013、1062，故根據實測保留指數（1056），可判斷化合物應為丁酸戊酯。保留時間為22.62 min位置的色譜峰，通過GC-MS的NIST標準譜庫檢索分析，獲得兩個相似度較高的化合物，按匹配度高低排序是順式-茴香腦（917）和對烯丙基茴香醚（891），經比對保留指數文獻值，可知順式-茴香腦和對烯丙基茴香醚的文獻值分別為1 209和1 196，與實測保留指數（1 195）相較，應判定該化合物為對烯丙基茴香醚。此外，異丁酸異戊酯、桉葉油醇、丙酸己酯、（-）-反式一松香芹醇、冰片、松香芹酮、（E）-2-甲基-2丁烯酸2-甲基烯丙酯等化合物的定性同樣須經保留指數輔助方可確認。通過質譜庫檢索結合保留指數法，可準確判定萬壽菊油揮發性成分。

表2 保留指數在萬壽菊油揮發性成分鑒定中的應用實例Table 2 Practical cases related to retention index on identifying volatile compound of the extracted oil from Tagetes Erecta L.flowers

3 結論

保留指數表示物質在固定液上的保留值行為，具有重現性好、標準統一及溫度系數小等優點，是國際上對天然產物常用的定性方法。由于天然香原料中的化合物普遍存在一些同分異構體或同系物，僅用質譜庫檢索和匹配度定性會出現多種可能性，使化合物的定性極為困難，甚至導致誤判。在分析結果中，化合物保留指數相同且質譜圖相同的概率極低。因此，保留指數法是復雜體系特別是中草藥[5，7]、香精香料[4]、食品[6]等學科分析工作中十分重要的定性依據。

本試驗從萬壽菊油中利用GC-MS可分離檢出50個組分，采用峰面積歸一化法估算各組分相對含量，結合保留指數共鑒定出39種揮發性成分，占總組分的97.99%，其中含量較高的組分為當歸酸-3-甲基戊酯（12.58%）、異丁酸異戊酯（11.08%）、（1S）-（-）-α蒎烯（10.91%）、丁酸異丁酯（10.38%）、（Z）-2-甲基-2丁烯酸2-甲基-丙酯（9.95%）以及異丁酸-4甲基戊酯（7.79%）。本文采用GC-MS譜庫檢索結合保留指數對萬壽菊油揮發性化學成分進行結構鑒定，較單純使用MS譜庫檢索鑒定更準確。如：本試驗中丁酸戊酯、對烯丙基茴香醚、異丁酸異戊酯、桉葉油醇、丙酸己酯、（-）-反式-松香芹醇、冰片、松香芹酮、（E）-2-甲基-2丁烯酸2-甲基烯丙酯等化合物的定性須經保留指數輔助方可確認。本試驗分離鑒定的主要成分在種類和相對含量上與文獻報道[14-16]的有一定差異，分析原因，除了萬壽菊油原料的產地、采收期、存儲以及精油提取方式等因素會對原料揮發性成分造成一定的影響外，樣品前處理方式和測定方法等因素也是影響鑒定結果差異的主要原因。