不同酵母對大米生料釀酒的釀造特性研究

李媛媛，李星，張立偉，蔡永陽，黃治國，2，*，任志強，2，*

（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

生料釀酒技術最早由日本人在20世紀50年代提出，20世紀70年代世界各國競相研究，我國的生料釀酒技術曾在20世紀80年代掀起過高潮[1]。生料釀酒與傳統釀酒相比，免去了浸泡、初蒸、燜糧等八道工序，節約燃料35%～60%，出酒率高，減少人工50%以上，降低生產成本30%以上，具有較高的社會和經濟效益，是現代釀酒行業的發展方向之一[2－4]。

不同的糧食釀出來的酒具有不同的特點；相同的糧食加入不同的微生物進行發酵，酒質也會有較大的差別，其原因可能為不同微生物的代謝通路存在一定的差別[5－6]。不同的釀酒原料的最適釀造微生物可能不同[7]。因此，篩選針對某一特定原料進行釀酒的微生物具有研究意義。

目前有很多關于相同曲藥、不同原料的生料釀酒釀造特性研究[8－10]；而很少有關于同一種原料，不同發酵微生物釀酒釀造特性研究。為了獲得針對以大米為原料，發酵性能優良、性狀穩定的生料釀造菌株，本研究通過構建大米生料釀酒實驗室研究平臺，對18株酵母進行了以大米為原料的生料釀酒發酵研究，篩選出一株較適合用于大米生料釀酒的微生物。該酵母可作為大米釀酒生料曲的備選菌株；該方法對生料釀酒的菌種篩選具有指導意義。針對不同的原料采用不同的微生物制備的生料曲進行釀造，以提高生料釀酒的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌：由四川理工學院釀酒重點實驗室菌種保藏中心提供；大米：市售秈米；糖化酶：江蘇博立生物制品有限公司；淀粉酶：上海康達食品工程有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

250HL恒溫恒濕培養箱：金壇市醫療儀器廠；VG－3渦旋振蕩器：德國進口；SHP生化培養箱：北京中興偉業儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母的活化與擴大培養

取釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室保存的酵母菌斜面，取酵母菌接種于含10 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基的試管中，28℃，120 r/min，24 h振蕩培養對酵母菌進行復蘇。將復蘇后的培養液采用劃線分離的方式劃線于PDA固體培養中，28℃恒溫培養24 h。

從活化后的培養基中挑取生長良好的酵母菌，接種于10 mL PDA液體培養基中，28℃，120 r/min培養12 h。1%的轉種量接種于150 mL PDA液體培養基中，28℃，120 r/min培養12 h獲得種子液。6 000 r/min離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌3次后獲得鮮酵母。

1.3.2 酒的發酵與蒸餾

大米100 g，自來水250 mL、糖化酶1 g、淀粉酶1 g，鮮酵母1 g（濕重），置于500 mL三角瓶中，攪拌均勻，保鮮膜封口，25℃發酵20 d。

將發酵好的發酵醪液全部轉移至圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，加入沸石，連接好蒸餾裝置進行蒸餾取酒；每個樣品蒸餾200 mL酒樣。

1.3.3 失重的測定

失重即經酵母發酵前后發酵液質量的變化。失重/g=原重－剩重

1.3.4 出酒率的測定

將1.3.2中蒸餾得到的酒樣用酒精計測得每組酒樣的酒精度，每組酒樣測3次，取平均值。

出酒率/%=酒精度×蒸餾后酒樣的量×乙醇的密度÷大米投加量

1.3.5 總酯的測定

吸取50 mL酒樣于圓底燒瓶中，加2滴酚酞指示劑，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至粉紅色，記錄消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積。再準確加入氫氧化鈉標準滴定溶液20 mL，加入3粒沸石并裝好冷凝回流裝置，于沸水浴上回流30 min，取下，冷卻。然后，用硫酸標準滴定溶液進行滴定，以微紅色剛好完全消失為其終點，記錄消耗硫酸標準滴定溶液的體積。同時吸取50 mL酒樣，做空白試驗作對照，記錄消耗硫酸標準滴定溶液的體積。

計算公式：

式中：X為酒樣中總酯的含量，g/L；c為硫酸標準滴定溶液的實際濃度，mol/L；V0為空白試驗樣品消耗0.1 mol/L H2SO4溶液的體積，mL；V1為樣品消耗0.1 mol/L H2SO4溶液的體積，mL。

1.3.6 總酸的測定

吸取50 mL酒樣于錐形瓶中，加酚酞2滴，以氫氧化鈉標準溶液滴定樣品至微紅色，即為其終點，并記錄數據。計算公式：

式中：X為酒樣中總酸的含量，g/L；C為氫氧化鈉標準滴定溶液的實際濃度，mol/L；V為消耗的氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL。

1.3.7 氣相色譜質譜條件

1.3.7.1 氣相色譜（gas chromatography，GC）條件

毛細管柱；程序升溫：初始溫度40℃保持1 min，然后以5℃/min升溫至180℃，保持1 min，再8℃/min升溫到230℃，保持7 min；進樣口溫度240℃；載氣：高純度氦氣（He），流速為1 mL/min；不分流進樣。

1.3.7.2 質譜（mass spectrometer，MS）條件

電子電離源（electronionization，EI），電子能力70eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，接口溫度230℃，質量掃描范圍20 u～50 u，溶劑延遲3 min。

1.3.8 定性與成分分析

定性分析：檢測出揮發性組分的質譜圖，通過與標準譜庫（NIST05a.L）對比鑒定，匹配度大于75%的予以確認。

成分分析：通過GC－MS分析檢測得出白酒的風味物質的總離子流圖，采用數據分析軟件進行譜庫（NIST8.0）檢索及相關文獻分析，對相應的風味物質成分進行鑒定。

2 結果與討論

市售生料釀酒曲至少包含有兩種微生物，根霉和酵母。其中，根霉主要提供糖化所需的酶類，將釀酒原料轉化成可發酵性糖，酵母的主要作用是將可發酵性糖轉變成乙醇[11]。試驗要探索不同酵母對大米生料釀酒的釀造特性，就要固定其他條件，只改變酵母的種類。為了最大限度的減少其他微生物對酵母的影響，本研究采用“糖化酶+酵母”的模式構建生料釀酒實驗室研究平臺。以相同的原料投加量，相同酶的投加量，相同的發酵溫度進行試驗，從失重、出酒率、總酯、總酸和風味物質等方面考查不同酵母對大米生料釀酒的釀造特性。

2.1 不同酵母生料發酵前后的失重

酵母將淀粉轉化為CO2、酒精和其他副產物等；在發酵期間失去的重量就是CO2的質量，CO2的產量越多，說明其發酵起步早、速度快，能較早的達到主發酵期，形成生長優勢，較好的抑制雜菌，使發酵過程中的生理生化反應正常進行，對酒的質量有初步的保證，酵母的發酵性能較為良好；本研究的18種酵母發酵前后失重數據見圖1。

圖1 不同酵母發酵前后的失重Fig.1 Weightlessness before and after fermentation of different yeast

如圖1，失重最高的是酵母1，達到了41.85 g；其中酵母18、酵母6、酵母10、酵母11、酵母15這5株酵母菌種的失重都超過了41 g，失重最低的是酵母12，只有25.52 g，在相同條件下，只是加入的酵母不同其失重也存在一定的差異，說明酵母的不同的確會影響發酵后發酵液里的物質成分。

2.2 不同酵母生料發酵的出酒率

酵母在分解大米中的淀粉時，酒精和CO2是同一反應的產物，即CO2產生的量越多，酒精產生越多；也就是說失重多，出酒率就高；失重直觀的反映了菌種在釀酒過程中對原料的使用情況，出酒率反映菌株對原料的轉化率；通過對這兩者的測定就能更好的反映不同酵母的發酵性能；酵母出酒率數據見圖2。

淀粉轉化為酒精的理論值為56.76%，而大米的淀粉含量為75%，如果按淀粉轉化為酒精是100%，大米的理論出酒率也只能達到42.57%[12]；但由于使用糖化酶，減少了霉菌對大米中淀粉的消耗，添加鮮酵母，酵母繁殖的淀粉消耗要少一些，如圖2可以看出這樣做其出酒率可以高達43.13%，但也有較低的出酒率為24.49%，其他都介于兩者之間，說明不同酵母大米生料發酵對出酒率的影響是不相同的。

圖2 不同酵母發酵后的出酒率Fig.2 The yield of wine after fermentation by different yeast

2.3 不同酵母生料釀酒對白酒總酯的影響

總酯是白酒中多種酯的總稱，它是白酒中重要的呈香呈味物質，總酯分析是白酒中重要的檢測項目，是判定白酒合格與否的重要指標之一[13]。乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯是白酒中的三大主要酯類，其含量占總酯的90%上，總酯越高，白酒越香，所以說要比較酵母的發酵性能，比較其產出酒的總酯含量是必須的。

對發酵蒸餾后的酒樣進行總酯的測定（具體方法見1.3.4）結果見圖3。

圖3 不同酵母對總酯的影響Fig.3 The effect of different yeast on the total ester

總酯含量最高的是酵母2，達到了0.69 g/L，最低的是酵母9，為0.45 g/L。其他的介于兩者之間。總體而言：酵母2、酵母15、酵母3的產酯能力較強，由圖3可知不同酵母以大米為原料進行生料釀酒時產酯能力是存在差別的，其可能的原因有酵母本身產酯的能力存在差別，也有可能是對原料的利用上存在差別，比如同一種菌對不同的原料進行發酵，其產酯能力也會存在差別[14]。

2.4 不同酵母生料釀酒對總酸的影響

白酒中的酸是主要呈味物質之一，對白酒而言，它的酸類物質主要由有機酸組成；酸與白酒中的酯、醇、醛等物質相比，其作用力最強，功能相當豐富，影響面廣，比如可以消除酒的苦味、是新酒老熟的有效催化劑、是白酒最重要的味感劑，同時還對白酒香氣有抑制和掩蓋作用，因此測定酒中的總酸含量也是必須的[15]。

對發酵蒸餾后的酒樣進行總酸的測定，結果如圖4。

總酸含量最高的是酵母13，達到了1 g/L，最低的是釀酒酵母5，為0.06 g/L。其他的介于兩者之間。總體而言：酵母13、酵母3、酵母12的產酸能力強，說明不同酵母大米生料發酵對產酸的影響是不相同的。

2.5 不同酵母生料發酵對白酒風味物質的影響

風味物質在白酒中只占3%左右，屬于白酒中的微量物質，而這些微量成分可通過嗅覺、視覺、觸覺和味覺引起感官的刺激，其種類、含量和量比關系決定著白酒香型和風味質量，所以對酵母發酵后酒中的風味物質的測定有一定的必要性。生料釀酒中主要的風味物質有奇數碳脂肪酸乙酯、正丙醇、高級脂肪酸乙酯和乳酸乙酯，而在本研究中不同酵母生成的酒主要測出有丙醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯3個成分，且不同酵母生成3種物質的量也各有不同，說明不同酵母對風味物質有一定的影響。

不同酵母生料發酵中白酒風味物質成分GC-MS分析。18種不同酵母發酵后酒樣的風味物質對比結果見圖5。

圖5 不同酵母發酵后對風味物質含量影響Fig.5 Effect of different yeast fermentation on flavor compounds content

從圖5中可以看出，不同酵母產酒的風味成分可能會有所不同，風味成分含量也有很大的區別，綜合來看酵母15、酵母3以及酵母10的3種風味物質含量很高，所以從風味物質的成分與含量來看這3種酵母的發酵性能較為良好。

3 結論

本研究通過不同酵母對大米的生料釀酒后，發酵液的失重、出酒率、總酯、總酸和風味物質的測定和對比篩選出以大米為原料生料釀酒的發酵性能較好的生產菌。結果表明：酵母1、酵母18、酵母6、酵母10、酵母11、酵母15這6株酵母菌種的失重都超過了41 g，失重越多說明該酵母能夠將淀粉轉化為酒精和二氧化碳的能力越強，因此發酵后的還原糖和總糖的殘余量就越低；酵母1、酵母6、菌株酵母10、酵母15、酵母18出酒率較高，出酒率都超過了40%；通過GC-MS測定氣相成分得知：酵母15產酯能力較強，產酯含量超過了0.50 g/L。從以上數據可以看出酵母15無論從失重、出酒率和酒中風味物質都要比其他菌株好，所以酵母15在以大米為原料的生料釀酒中具有一定的優勢，適合作為生產菌。