蓖麻基因組DNA提取方法研究進展

風蘭 李國瑞 黃鳳蘭 白英俊 李孟建 孫佳欣 韓雯毓 陳永勝

摘要 目前，基因組DNA的提取已有多種方法，但是不同的方法具有各自的優缺點。本文介紹了蓖麻基因組DNA提取原理，并敘述了近年來提取蓖麻基因組DNA的主要方法，如CTAB法、SDS法、試劑盒法、磁性微球法，通過比較這些不同提取方法的優缺點，分析了影響DNA純度的因素，如樣本的采集與保存、提取緩沖液成分的作用、DNA提取純化方法等，以期為蓖麻相關研究提供理論基礎。

關鍵詞 蓖麻；基因組DNA；提取方法

中圖分類號 S565.6 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）17-0005-02

Abstract At present，there are many methods for the extraction of genomic DNA，but different methods have their own advantages and disadvantages.In this paper，the principle of plant genomic DNA extraction was introduced，and several main methods of castor genomic DNA extraction in recent years，such as CTAB method，SDS method，kit method and magnetic microsphere method were summarized.The advantages and disadvantages of different methods were compared，and the influencing factors of DNA purity were analyzed，such as sample collection and preservation，the extraction buffer components，and purification methods of DNA，so as to provide theoretical basis for the molecular biology research of castor.

Key words castor；genomic DNA；extraction method

蓖麻（Ricinus communis L.）屬于大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricinus）油料作物[1]，原產于非洲東部，我國已有逾1 500年的栽培歷史，栽培種植區主要集中在華北、東北等地區[2]。蓖麻具有適應性廣、綜合利用價值高[3]、抗逆性強等特點。隨著蓖麻被更多地應用于社會各個生產領域，蓖麻遺傳分析等研究也正在迅速發展。利用分子手段輔助蓖麻科研育種，對促進蓖麻產業化發展具有重要意義[4]。

基因組DNA的提取是蓖麻遺傳性狀分析的基礎，同時還關系到蓖麻基因文庫建立、PCR、RFLP、RAPD等分子生物學研究。因此，快速獲得高質量DNA是保證其下游生物學應用的重要前提。在DNA提取過程中，采樣時間、提取方法及純化技術等因素均對DNA質量有較大影響。目前，常用的蓖麻基因組DNA提取方法為CTAB法[5-8]、SDS法[6，8-9]、磁性微球法[10]以及試劑盒法[11]等。這些方法在原理上大同小異，在DNA提取步驟上主要以組織細胞裂解破碎、釋放DNA、去除雜質及純化DNA等4步為主。本文對現有的蓖麻基因組DNA提取方法進行了比較分析，分別敘述其優缺點，以期為蓖麻分子生物學研究提供理論基礎。

1 提取原理

1.1 細胞裂解破碎

一般情況下，在液氮中磨碎植物的組織和細胞。液氮處理后，可以使樣品變硬、變脆，更容易裂解；經過液氮的速冷后，對樣品進行進一步研磨時可以保證DNA充分、均勻地釋放；液氮可以提供一個低溫環境，防止DNA被DNA酶降解，從而保證基因組DNA的穩定性。

1.2 DNA釋放

細胞核中的DNA通常以DNA-蛋白質復合物（DNP）的形式存在。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）等離子型表面活性劑，具有溶解核膜蛋白和細胞膜的作用，使核蛋白解聚，從而游離出DNA。

1.3 蛋白質去除

核酸通常與某些蛋白質結合成復合物，存在于細胞核中。因此，將蛋白質與核酸分離后才能獲得核酸。提取DNA過程中，一般使用氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）等使蛋白變性，從而留在有機相或中間相，而DNA則留在水相。在具體操作過程中，可以單獨使用氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）[12]，也可以增加氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）的抽提次數[13]。

1.4 次生代謝產物去除

植物細胞中含有大量的次生代謝產物，如多糖、多酚、脂類、色素等[14]。提取DNA時，次級代謝產物與DNA共沉淀形成膠體，難以溶解或產生褐變，從而影響DNA的提取和純化[15]。一般在提取介質中加入β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗壞血酸等抗氧化劑，可以有效去除次級代謝產物對DNA的影響[16]。

1.5 RNA去除

高質量的DNA應不包含或僅含有非常少的RNA。通常可以用RNase在37 ℃下消化1～2 h，以去除樣品中的RNA。

2 提取方法

蓖麻含有豐富的多糖、多酚和色素等大分子物質[8-9]，因此提取蓖麻基因組DNA難度較大。目前，提取蓖麻基因組DNA的主要方法有磁性微球法、試劑盒、SDS法、CTAB法。

2.1 CTAB法

CTAB是一種陽離子去污劑，能溶解細胞膜并與核酸形成復合物。它溶于高鹽溶液（0.7 mol/L NaCl），而當鹽濃度降低到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時，CTAB和核酸形成復合物，通過離心可從蛋白質和多糖中分離出來。將CTAB溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇時核酸形成沉淀，而CTAB溶于乙醇中[17]。

CTAB法最大優點是可以去除酚類和碳水化合物等高分子雜質，在提取早期可獲得高含量的DNA，可進一步純化獲得高質量的DNA[18]。但CTAB法耗時較長，同時提取所用試劑均要用原始藥品配制，稍有偏差就會影響DNA提取質量。因此，在大量集中提取DNA時建議選用CTAB法。

王亞[6]通過改良CTAB法，從蓖麻葉片中提取DNA，具體方法：一是將溶解后的DNA加入RNase A去除RNA；二是在提取過程中加入β-巰基乙醇，有效去除酚類物質；三是利用氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）抽提，去除蛋白質，進一步對粗提物進行純化。改良的CTAB法得到的蓖麻基因組DNA純度和質量較高，蛋白質等雜質去除的較干凈。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的DNA條帶整齊，亮度高，無拖尾。

2.2 SDS法

SDS是一種陰離子去污劑，可在高鹽條件下溶解細胞膜以及使蛋白質變性。SDS與核酸形成復合物，通過離心與多糖、蛋白質等大分子物質分開。加入乙醇時SDS溶解于乙醇中，核酸形成沉淀。采用SDS法提取蓖麻基因組DNA操作簡便，費用低廉。

黃文霞等[9]采用了改進的SDS法從蓖麻葉中提取DNA。具體的改進方法如下：一是采用新鮮葉片，在常溫下用石英砂快速研磨至粉末狀，并迅速轉移到含有PVP和β-巰基乙醇的SDS提取液中，從而有效避免了褐變；二是在用氯仿：異戊醇（24∶1，v/v）提取之前，增加一次離心步驟，并用低濃度NaAc沉淀DNA，最后得到較純的DNA。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的DNA條帶較亮，無明顯的模帶。

2.3 試劑盒法

提取蓖麻基因組DNA，也可以用通用的植物基因組DNA提取試劑盒來提取。試劑盒廠家不同，提取步驟也稍有差異。目前用于植物基因組DNA提取的試劑盒普及廣泛，如北京索萊寶科技有限公司、北京莊盟國際生物基因科技有限公司等。

一般情況下，通過試劑盒提取的DNA濃度較高，質量較好，且提取耗時少（一般1～2 h），基本上不再需要酚、氯仿等對人體有害的有機溶劑。因此，在試驗材料較少或試驗要求DNA質量較高時建議選用試劑盒法。但試劑盒法較其他方法成本高，是限制其應用的重要因素之一。

黃鳳蘭等[11]利用DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取蓖麻葉片DNA并對其提取步驟進行了改良優化。在原試劑盒的操作基礎上，消化時間調整為50 min、用冰預冷乙醇、將材料用量改為100 mg、使用60 μL洗脫液后，最終獲得了較高質量的蓖麻基因組DNA。

2.4 磁性微球法

磁性微球的原理是在NaCl和聚乙二醇（PEG）溶液中，DNA分子團聚成球形，其磷酸基團能通過氫鍵與硅包覆磁性微球表面的羥基結合，從而吸附到硅包覆磁性微球表面，與其他蛋白質等大分子物質分離開來，然后用外加磁場從樣品溶液中分離出載有核酸的磁性微球。經過適當的清洗去除PEG和NaCl時，DNA分子從磁性微球表面脫附，得到純化的DNA。

磁性微球法不需要使用有毒化學試劑、操作簡單、提取率高、周期短，且得到的樣品純度高。

王雅凡等[10]采用溶劑熱方法合成Fe3O4磁性微球，在其表面進行硅包覆，將其應用于蓖麻葉DNA提取，最后得到了高質量的DNA。

3 蓖麻基因組DNA純度的影響因素

3.1 材料選擇

植物組織的選取對基因組DNA的提取有很大影響。健康、幼嫩、處于分裂旺盛階段的植物葉片細胞，含有更完整的DNA和較少的代謝物。因此，提取基因組DNA時盡量選擇新鮮、幼嫩的葉片。

3.2 材料保存

采集蓖麻葉片后，立刻置于液氮中進行冷凍保存，并且運回實驗室后應盡快提取基因組DNA。或者從液氮中取出后直接放入-80 ℃超低溫冰箱中，可長期保存樣品。

3.3 基因組DNA提取過程

3.3.1 離心過程。離心強度要適中。離心強度過強時，可能會導致沉淀重新溶解困難；而如果轉速不夠或者時間過短時，產生的葉綠素、蛋白質等雜質過多。

3.3.2 水浴過程。水浴過程中，不能采用機械振蕩方式，應采用搖晃法混勻，否則會影響DNA提取的效果。

3.3.3 研磨過程。研磨方法和速度等是影響基因組DNA提取純度的重要因素。必須將蓖麻材料在液氮速冷的條件下快速研磨，同時要控制研磨速度，保證提取的DNA含量和純度更高。在加入提取液之前必須保持冷凍狀態，否則會影響DNA提取的質量。

3.4 基因組DNA提取條件

3.4.1 溫度。基因提取過程中，如果溫度太高（超過15 ℃），DNA可能會斷裂。因此，提取過程應盡可能在低溫下進行。在夏季高溫時，可在冰浴條件下進行DNA的提取。水浴時間對DNA的提取效果也有一定的影響。水浴保溫是為了在高溫（65 ℃）下鈍化內源性核酸酶的活性，一般為30～60 min[19]。

3.4.2 機械強度。機械強度越大，DNA分子越容易發生斷裂。因此，在提取過程中要操作輕緩柔和，同時盡量避免溶液反復轉移和劇烈震蕩[19]。在轉移DNA溶液時可以剪去槍頭的尖部，吸取時盡量避免因反復吸打而產生氣泡[20]。

4 結語

基因組DNA的提取是蓖麻分子生物學研究的基礎，只有在獲得高質量基因組DNA時，才能更好地進行后續的相關試驗[21-22]。近年來，在農作物中對蓖麻的研究逐漸增多，對其基因組的探究也越來越深入。因此，在蓖麻分子生物學領域的研究中，基因組DNA提取方法的改良尤為重要。對蓖麻已有的4種基因組DNA提取方法比較而言，如果要求DNA質量較高時建議選擇試劑盒法；而大量集中提取DNA且DNA質量要求不高時，這4種方法都可以，但在經濟條件允許的情況下還是建議優先選擇試劑盒法，因為該方法耗時短、操作簡單且易獲得高質量DNA。在后續研究中，無論是選擇哪種方法，仍然需要進一步優化，可從試劑的選擇、材料處理、藥品濃度和操作次數等多個方面進行優化，從而找出一種最適合的蓖麻基因組DNA提取方法。

5 參考文獻

[1] MENDES M G，SANTOS JUNIOR C D，DIAS A C，et al.Castor bean（Ricinus communis L.）as a potential environmental bioindicator[J].Genetics and Molecular Research，2015，14（4）：12880-12887.

[2] 張研，喬金友.淺析中國蓖麻產業化發展前景[J].中國農學通報，2009，25（16）：316-319.

[3] 孫振鈞，呂麗媛，伍玉鵬.蓖麻產業發展：從種植到利用[J].中國農業大學學報，2012，17（6）：204-214.

[4] WANG Y，XU W，CHEN Z，et al.Gene structure，expression pattern and interaction of Nuclear Factor-Y family in castor bean（Ricinus communis）[J].Planta，2018，247（3）：559-572.

[5] 張智勇，倪娜，李國瑞，等.快速提取蓖麻基因組DNA不同方法的比較[J].北方農業學報，2013（4）：20-22.

[6] 王亞.蓖麻單雌性狀的ISSR分析[D].太原：山西大學，2010.

[7] 陳永勝，郝衛國，譚穎，等.RAPD標記蓖麻單雌性狀的反應體系優化[J].作物雜志，2008（1）：31-33.

[8] 譚美蓮，姜興華，嚴明芳，等.蓖麻DNA的提取及SRAP反應體系的建立[J].中國油料作物學報，2009，31（4）：531-536.

[9] 黃文霞，何覺民，朱宏波.一種適于PCR 擴增的蓖麻基因組DNA提取方法[J].中國農學通報，2007，23（11）：61-63.

[10] 王雅凡，黃艷鳳，楊華，等.制備硅包覆的磁性微球用于蓖麻葉DNA的提取[J].現代生物醫學進展，2010，17（10）：3205-3208.

[11] 黃鳳蘭，郭志強，孟凡娟，等.試劑盒法提取蓖麻基因組DNA的條件優化[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版），2010，25（1）：29-33.

[12] 袁長春，施蘇華，葉創興.從富含酚類的茶類植物葉中提取純凈的總DNA[J].中山大學學報論叢，2001，21（3）：1-4.

[13] MARTIN M P，WINKA K.Alternative methods of extracting and amplify-ing DNA from lichens[J].Lichenologist，2000，32（2）：189-196.

[14] 陳林楊，宋敏舒，查紅光，等.一種改良的植物基因組DNA通用提取方法[J].植物分類與資源學報，2014，36（3）：375-380.

[15] 趙懷寶，馮建榮，蔣迪軍，等.葡萄DNA提取與純化方法的比較研究[J].石河子大學學報（自然科學版），2000，4（2）：117-121.

[16] 許婉芳.去除頑拗植物DNA提取過程中干擾物質的方法[J].閩西職業大學學報，2002（3）：55-57.

[17] 蔣細旺，包滿珠，李智崎，等.菊花DNA提純方法的優化[J].江漢大學學報，2002，19（3）：42.

[18] 徐建堂，祁建民，方平平，等.CTAB法提取紅麻總DNA技術優化與ISSR和SRAP擴增效果[J].中國麻業科學，2007，29（4）：179-183.

[19] 黃曉丹，張云貴，應鐵進.高質量植物基因組DNA的提取[J].植物生理學通訊，2006，42（2）：311-314.

[20] 遲婧，耿麗麗，高繼國，等.植物葉片基因組DNA快速提取方法[J].生物技術通訊，2014（9）：51-57.

[21] 于得水，劉金榮，周玉雷，等.翦股穎屬植物基因組DNA提取方法的比較[J].廣東農業科學，2009（12）：164-167.

[22] 張慧，張小平，李曉紅，等.青檀基因組DNA提取方法的優化[J].安徽師范大學學報（自然科學版），2011，34（3）：256-259.