飼糧中添加共軛亞油酸對豬肌肉組織miRNA表達譜的影響

王 琪，齊仁立，劉 虹，王 敬，黃金秀*

(1. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460； 2. 農業部養豬科學重點實驗室，重慶 402460)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是一類含有共軛雙鍵的十八碳脂肪酸的統稱，常見于反芻動物的脂肪中，具有抗腫瘤、改善動物免疫、抑制氧化應激、減少體內脂肪沉積和調控肌肉生長等多種生理功能[1-3]。肌肉組織是動物體內最重要的組織之一，研究表明，CLA可通過改變骨骼肌的肌纖維類型來改善豬肉品質；CLA還能通過影響肌肉的生理變化如調控肌肉代謝信號傳導通路、影響肌肉能量代謝，從而增加動物機體瘦肉重和改變肌肉蛋白質含量[4-6]。

microRNAs(miRNAs)是一類長度為20～24 nt的非編碼小RNA。miRNA通過堿基互補配對與靶基因 3′非編碼區結合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，在轉錄后水平調節基因表達，從而參與多種生物學功能[7]。研究證實，miRNA在肌肉細胞分化和組織生長發育過程中發揮重要作用，而動物膳食結構的改變能影響其肌肉組織miRNA的表達；如肥胖小鼠飼糧中添加煙酸可顯著改變骨骼肌中42個miRNAs表達[8-9]，生長豬飼喂不同能量來源的飼糧能顯著影響肌肉組織中miR-23a、miR-409和miR-208b的表達[10]。飼糧中添加CLA也能影響機體組織miRNA表達，但目前CLA對miRNA表達影響的研究僅集中在脂肪上，Parra等[11-12]發現，小鼠飼糧中添加CLA能顯著改變脂肪組織中miR-143、miR-103和miR-107等的表達，豬飼糧中添加CLA則能顯著下調脂肪組織miR-143和miR-27的表達。

本實驗室前期研究發現，生長育肥期飼糧中添加1%～1.5% CLA能顯著促進生長豬背最長肌的重量，增加肌內脂肪的含量并改變肌肉中脂肪酸的組成[13-14]。Corino等[15]研究證實，母豬妊娠期和泌乳期飼糧添加CLA可顯著提高仔豬生長性能。然而，飼糧中長期添加CLA對豬肌肉miRNA表達譜造成怎樣的影響及其存在的分子機理目前還未見報道。因此，本試驗在母豬及其子代飼糧中添加1.5% CLA，研究其對于子代肌肉組織miRNA表達譜的影響，從而探明CLA對豬肌肉組織中miRNA的調控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和樣品采集

試驗選取12頭平均體重為60.83 kg和背膘厚為24.16 mm的初產榮昌母豬，隨機分為對照組和CLA組，每組6個重復，每個重復1頭母豬。CLA組母豬的飼糧從妊娠初期開始添加1.5% CLA混合物，持續到仔豬28日齡斷奶；仔豬斷奶后，按照公母各半的原則分別從對照組和CLA組挑選健康仔豬各30頭，分成6個重復，每個重復5頭仔豬；斷奶后原CLA組仔豬飼糧中繼續添加1.5% CLA混合物，對照組仔豬飼糧中不添加。對照組母豬和斷奶后仔豬的飼養水平參照榮昌豬飼養標準(GB/T 7223-2008)和中國豬飼養標準(NY/T65-2004)進行配制，試驗組飼糧中的CLA等比例替代基礎飼糧中的大豆油，其他組分和營養成分與對照組一致。仔豬30 kg左右時，每組選擇6頭仔豬(3頭母豬和3頭公豬)進行屠宰，采集背最長肌(背肌)及腿肌組織樣品，于液氮速凍后轉移至-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 RNA文庫的構建

Trizol試劑法提取肌肉組織總RNA，每組3份樣品進行等量混合，檢測混合后總RNA質量，保證RIN(RNA integrity number)值為7.5～9.0。使用PAGE膠分離不同片段大小的RNA，切取18～30 nt之間的條帶進行回收；分別配制3′和5′連接體系，混勻離心后適溫連接；配制反轉錄體系，在PCR儀上適溫反應一定時間，使連接產物反轉錄成雙鏈，再配制PCR反應體系，在PCR儀上按照一定程序進行擴增；使用PAGE膠對PCR產物進行切膠回收純化，完成文庫構建。分別對對照組和CLA組的背肌和腿肌(混樣)進行建庫，每個組設定一個重復，因此共有8個庫，包括背肌對照組Ⅰ、背肌對照組Ⅱ、背肌CLA組Ⅰ、背肌CLA組Ⅱ、腿肌對照組Ⅰ、腿肌對照組Ⅱ、腿肌CLA組Ⅰ和腿肌CLA組Ⅱ。構建好的文庫進行質檢后在Illumina HiSeq 2000 平臺進行高通量測序，測序工作由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 已知miRNA的鑒定

測序原始序列(raw reads)去除低質量、接頭污染和長度小于18 nt的序列，獲得clean reads。通過SOAP和bowtie將篩選后的sRNA定位到豬參考基因組上(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/gtf/sus_scrofa/)，去除rRNA、tRNA、scRNA、snRNA和snoRNA等小RNA。然后將剩余序列與miRBase 21.0 (http://www. mirbase.org/)中豬的已知miRNA進行比對，確定已知的miRNA，用mirdeep軟件預測新miRNA。

1.4 差異表達miRNA篩選和候選靶基因功能分析

對樣本中已知miRNA進行表達量的統計，用TPM[16]進行表達量歸一化處理，采用SPSS 18.0中的描述統計(descriptive statistics)分析數據，以“平均值±標準差”表示miRNA表達量。使用ExpDiff方法比較對照組和CLA組之間miRNA表達量的差異，分析對照組和CLA組中已知miRNA的差異倍數(fold change)及P值，篩選差異表達的miRNA。用miRanda和RNAhybrid軟件對差異表達的已知miRNA進行靶基因預測，取交集作為預測結果。使用KEGG代謝通路分析確定候選靶基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

1.5 熒光定量PCR驗證測序

為驗證高通量測序結果的準確性，在背肌和腿肌各選擇3個差異表達的miRNAs進行熒光定量PCR試驗。按照反轉錄SYBR?Prime ScriptRMmiRNA RT-PCR試劑盒(TaKaRa，Japan)的說明書步驟獲得cDNA，特異性上游引物根據所選miRNA的自身序列進行設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)，下游引物為通用引物，選擇U6為內參基因。用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa，Japan)進行熒光定量PCR反應，體系：模板2.0 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX Reference Dye, 0.8 μL miRNA特異引物，0.8 μL下游引物(試劑盒自帶)，加ddH2O使總體積為20 μL。所有的反應設置3個重復，數據結果通過2-△△CT法進行相對定量的統計分析。

表1熒光定量PCR引物序列

Table1TheprimerssequenceforqRT-PCR

miRNA名稱miRNA name引物序列(5'→3')Primer sequencessc-miR-224CAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAssc-miR-4332CACGGCCGCCGCCGGGCGCCssc-miR-628ATGCTGACATATTTACTAGAGGssc-miR-151-5pTCGAGGAGCTCACAGTCTAGTssc-miR-144TACAGTATAGATGATGTACssc-miR-1285CTGGGCAACATAGCGAGACCCCGTU6GCTTCGGCAGCACATATACT

2 結 果

2.1 豬肌肉組織測序數據過濾和sRNA序列信息

經過Solexa測序得到的raw data數據進行過濾處理，主要包括去除接頭、污染及低質量序列等。本試驗一共構建8個文庫，背肌組4個文庫總共獲得了44 869 982條clean reads，占總數的95.10%；而腿肌組4個文庫則獲得了45 105 806條clean reads，占總數的95.09%(表2)。背肌和腿肌中小RNA序列長度分布見圖1，絕大多數序列長度為20～23 nt，其中22 nt長度序列占的比例最大。miRNA在由前體發育為成熟體時其過程是由Dicer酶切完成的，酶切位點的特異性使得miRNA成熟體的首位堿基具有很強的偏好性，圖2統計了背肌和腿肌中長度為18～30 nt miRNA首位堿基分布情況，發現第一個堿基對U具有強烈的偏好性。

2.2 豬肌肉組織已知miRNA鑒定分析

通過blast或bowtie將sRNA與miRBase 21.0中豬(Susscrofa)miRNAs序列進行比對，背肌和腿肌組織中分別鑒定出306和304個已知miRNAs，有295個miRNAs共表達，其中ssc-miR-206、ssc-miR-1、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-26a、ssc-miR-10b和ssc-miR-128等多個miRNAs在背肌和腿肌組織中均高表達。作為肌肉特異性miRNA,ssc-miR-1、ssc-miR-206和ssc-miR-133a-3p的表達量均超過百萬拷貝數(圖3)。

2.3 添加CLA對豬肌肉miRNA表達的影響

在飼糧中持續添加CLA影響豬背肌和腿肌miRNA表達，對CLA組和對照組標準化之后的表達值進行差異比較，并把差異倍數取2為底的對數，以log2(Fold change)表示，正值代表上調，負值代表下調。結果表明，添加CLA后背肌中有151個miRNA表達上調，155個表達下調；腿肌中有141個miRNA表達上調，163個表達下調。腿肌中有17個miRNAs的log2(Fold change)大于1，而背肌中只有7個；腿肌中有13個miRNA的log2(Fold change)小于-1，而背肌中只有6個(表3)。說明CLA對腿肌miRNA表達的影響要強于背肌。

表2測序文庫的小RNA片段質量分類

Table2TheclassificationofsmallRNAtagsinsequencinglibraries

分類Type背肌 Back muscle對照組IControl group I對照組IIControl group IICLA組ICLA group ICLA組IICLA group II原始序列Total reads12 039 29011 319 17212 054 53411 766 943高質量序列High quality11 992 92111 268 06612 001 61311 712 746無3'接頭 3'adapter null211 522255 760172 667188 809無插入片段Insert null123 251111 545155 638150 7135'接頭污染 5'adapter contaminant29 96325 70934 71627 803小于18 nt Smaller than 18 nt111 414117 133158 020230 238包含polyA Poly A72126122143純凈序列Clean reads11 516 69910 757 79311 480 45011 115 040分類Type腿肌 Leg muscle對照組IControl group I對照組IIControl group IICLA組ICLA group ICLA組IICLA group II原始序列Total reads11 319 17211 547 16412 419 84212 144 824高質量序列High quality11 268 06611 496 61012 363 66012 098 777無3'接頭 3'adapter null255 760187 021214 316292 296無插入片段Insert null111 545103 416111 132201 3195'接頭污染 5'adapter contaminant25 70931 03547 27148 732小于18 nt Smaller than 18 nt117 133120 093114 339139 781包含polyA Poly A1261457563純凈序列Clean reads10 757 79311 054 90011 876 52711 416 586

每個組設定一個重復，以I和II表示

The replicate expressed as I and II in each group

以log2(Fold change)>1或<-1，P<0.05 為標準篩選對照組和CLA組之間顯著差異表達的miRNA，發現飼糧中添加CLA顯著改變了背肌中ssc-miR-224、ssc-miR-9841-3p、ssc-miR-4332、ssc-miR-628和ssc-miR-339-3p的表達；顯著改變了腿肌中12個miRNAs的表達，其中5個表達上調，7個表達下調，其中只有ssc-miR-224在豬背肌和腿肌都差異表達(表4)。此外，背肌和腿肌組織中有8個差異表達miRNAs的差異倍數發生了4倍以上的改變，包括背肌中的ssc-miR-9841-3p和ssc-miR-339-3p，以及腿肌中的ssc-miR-151-5p、ssc-miR-215、ssc-miR-194b-5p、ssc-miR-452、ssc-miR-205和ssc-miR-545-3p。

2.4 肌肉中16個差異表達miRNA的靶基因預測和功能分析

CLA組豬的背肌和腿肌中分別有5個和12個miRNAs顯著差異表達，其中ssc-miR-224在兩種組織中都差異表達，因此共有16個差異表達miRNAs。用RNAhybrid和miRanda分析軟件對差異表達的16個miRNAs進行靶基因預測，共預測到5 155個靶基因。對靶基因進行KEGG功能分析，發現其共富集到292條生物學通路中，其中有24個顯著富集通路(P<0.05，表5)。顯著富集通路中，Notch信號通路和MAPK信號通路都曾報道與肌肉發育和代謝密切相關。靶基因富集最多的前5個通路包括：代謝通路(376個)、肌動蛋白細胞骨架調控(182個)、癌癥通路(160個)、黏著斑(148個)、MAPK信號通路(138個)，其中，肌動蛋白細胞骨架調控、黏著斑和MAPK信號通路都為顯著富集通路(P<0.05)。

2.5 熒光定量PCR驗證差異表達miRNA

在表4中隨機選擇6個差異表達的miRNAs，進行熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證。在背肌中檢測ssc-miR-224、ssc-miR-4332和ssc-miR-628的表達，在腿肌中則檢測ssc-miR-151-5p、ssc-miR-144和ssc-miR-1285的表達。qRT-PCR結果采用 2-△△CT進行計算，并以log2(CLA組/對照組)得出相對表達情況。由圖4可知，miRNA的表達變化趨勢與測序結果基本一致，但qRT-PCR檢測到的表達水平變化幅度要小于測序。

圖1 背肌(A)和腿肌(B)中小RNA序列長度分布Fig.1 Length distribution of small RNA sequence in back muscle(A) and leg muscle(B)

圖2 背肌(A)和腿肌(B)中18～30 nt miRNA的首位堿基偏向性Fig.2 First nucleotide bias of miRNA with 18-30 nt in back muscle(A) and leg muscle(B)

圖3 背肌(A)和腿肌(B)表達量前10的miRNAsFig.3 The top 10 expressed miRNAs in back muscle(A) and leg muscle(B)

表3添加CLA后對背肌和腿肌中miRNAs差異表達倍數的影響

Table3EffectsofCLAsupplementationonlog2(Foldchange)ofmiRNAsinbackmuscleandlegmuscle

log2差異倍數log2(Fold change)背肌Back muscle腿肌Leg musclemiRNAs數量Number of miRNAs百分比/%PercentmiRNAs數量Number of miRNAs百分比/%Percent>300.0020.66>1且≤372.29154.93>0.5且≤1237.52237.57>0.1且≤0.57825.496822.37>0且≤0.14314.053310.86>-0.1且≤0299.48299.54≤-0.1且>-0.510133.017825.66≤-0.5且>-1196.214314.14≤-1且>-361.96134.28

表4添加CLA后肌肉中顯著差異表達的miRNAs

Table4SignificantdifferentiallyexpressedmiRNAsinmuscleresponsingtoCLAtreatment

miRNA名稱miRNA name對照組Control groupCLA組CLA group差異倍數Fold changelog2差異倍數log2(Fold change)P值P-value背肌Back musclessc-miR-22443.08±6.9620.40±4.500.47-1.080.01ssc-miR-9841-3p0.93±0.147.26±0.907.772.960.01ssc-miR-43325.40±0.4116.33±3.503.031.600.01ssc-miR-62820.63±0.7043.16±4.242.091.070.01ssc-miR-339-3p1.52±0.507.00±1.514.602.200.04腿肌Leg musclessc-miR-151-5p702.27±34.654 148.04±388.315.912.560.00ssc-miR-2156.81±1.2863.30±2.739.303.220.00ssc-miR-194b-5p1.98±0.0024.60±3.2312.423.630.00ssc-miR-12275.37±9.19231.04±38.893.071.620.00ssc-miR-45271.78±6.8715.58±4.340.22-2.200.00ssc-miR-144554.78±53.50254.21±49.000.46-1.130.00ssc-miR-18434.03±4.1499.47±9.092.921.550.01ssc-miR-1285293.46±26.87143.85±13.440.49-1.030.01ssc-miR-22488.18±8.2829.35±2.820.33-1.590.01ssc-miR-20514.20±2.533.14±0.830.22-2.180.03ssc-miR-299118.55±7.0753.28±4.740.45-1.150.03ssc-miR-545-3p9.38±0.711.60±0.500.17-2.550.03

表516個差異表達miRNAs靶基因的KEGG通路富集分析

Table5KEGGpathwayanalysisfortargetgenesof16differentiallyexpressedmiRNAs

KEGG通路KEGG pathway靶基因數 Gene numberP值P-value通路ID號Pathway ID氨基苯甲酸降解Aminobenzoate degradation120.000ko00627血管平滑肌收縮Vascular smooth muscle contraction1250.000ko04270心肌收縮Cardiac muscle contraction820.001ko04260晝夜節律-植物Circadian rhythm-plant60.001ko04712緊密連接Tight junction1270.001ko04530軸突導向Axon guidance1130.002ko04360葉酸合成Folate biosynthesis130.002ko00790肌動蛋白細胞骨架調控Regulation of actin cytoskeleton1820.002ko04810酗酒Alcoholism790.002ko050345-羥色胺能神經突觸Serotonergic synapse690.003ko04726肥厚型心肌病Hypertrophic cardiomyopathy (HCM)1090.005ko05410唾液分泌Salivary secretion600.008ko04970可卡因成癮Cocaine addiction350.009ko05030谷氨酸能突觸Glutamatergic synapse670.011ko04724擴張型心肌病Dilated cardiomyopathy1090.011ko05414胰島素信號通路Insulin signaling pathway860.013ko04910致病性大腸埃希菌感染Pathogenic Escherichia coli infection590.016ko05130沙門氏菌感染Salmonella infection890.023ko05132丁酰苷菌素和新霉素的生物合成Butirosin and neomycin biosynthesis60.024ko00524Notch信號通路Notch signaling pathway310.032ko04330雙組分系統Two-component system200.034ko02020黏著連接Adherens junction630.035ko04520黏著斑Focal adhesion1480.043ko04510MAPK信號通路MAPK signaling pathway1380.044ko04010

A.背肌； B. 腿肌A.Back muscle； B. Leg muscle圖4 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證Fig.4 qRT-PCR validation for the differentially expressed miRNA

3 討 論

3.1 豬肌肉組織中高表達的miRNA

骨骼肌是機體進行能量代謝的主要場所，主要作用是控制運動及維持姿勢。所有的身體活動和體育活動，都是由骨骼肌收縮完成[17]。miRNA作為重要的調控因子，與骨骼肌的發育代謝密切相關[18]。本研究中，背肌和腿肌表達量前10的miRNAs包括ssc-miR-206、ssc-miR-1、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-26a、ssc-miR-10b、ssc-miR-128、ssc-miR-378、ssc-let-7a、ssc-miR-126-3p和ssc-miR-22-3p。其中，miR-206、miR-1和miR-133a-3p屬于肌源miRNA，主要參與肌細胞增殖和分化等過程[19]。Qin等[20]研究發現，miR-26a、miR-10b、miR-128、miR-378和let-7a在豬骨骼肌中高表達，與本研究的結果一致。另外兩個高表達miRNAs，miR-126-3p和miR-22-3p則報道與平滑肌細胞的增殖有關[21-22]。結果說明，這些高表達的miRNA在肌肉組織中發揮著重要的生物學功能。

3.2 添加CLA后肌肉中差異表達miRNA功能分析

CLA對miRNA表達影響的研究主要集中在脂肪上，目前尚未有CLA對肌肉組織miRNA表達譜影響的報道。本研究通過在豬飼糧中添加1.5% CLA，對豬背肌和腿肌組織進行miRNA測序和生物信息學分析，旨在探明miRNA在CLA調控肌肉發育和代謝中發揮何種作用。結果顯示，添加CLA對腿肌miRNA表達的影響要強于背肌，說明CLA對不同的部位肌肉影響效果不同。背肌和腿肌組織中共發現16個差異顯著表達的miRNAs，其中只有ssc-miR-224在兩種組織中都差異表達。有報道稱，miR-224與動物脂肪細胞的成脂分化相關，可通過長鏈酰基輔酶A合成酶4(ACSL4)調節脂肪酸代謝；也有報道認為，miR-224通過調控過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARα)的轉錄水平，從而影響脂肪酸分解代謝并控制脂肪堆積[23-24]。另外15個差異表達的miRNAs中，Wang等[25-29]研究認為，miR-4332能調控豬肌肉中脂肪沉積，miR-122、miR-215、miR-194和miR-205等則被證實與脂代謝相關；其他一些miRNAs，如miR-628、miR-151-5p和miR-339-3p等報道與肌肉的發育或疾病的發生有關[30-32]。說明CLA可能通過影響肌肉中重要miRNA表達調控肌肉脂肪沉積和發育代謝。

3.3 差異表達miRNAs靶基因功能和通路分析

通過對16個差異表達miRNAs靶基因進行功能分析，發現5 155個靶基因顯著富集到24條代謝通路中，其中MAPK信號通路和Notch信號通路與肌肉代謝密切相關。MAPK家族成員主要包括P38 MAPK、ERK 1/2和JNK，這些因子參與到細胞的生長發育、增殖分化、凋亡等多種生理過程[33-34]。Segalés等[35-37]發現，這3條MAPK通路在調控肌細胞的成脂轉分化中起到不同的作用，抑制P38 MAPK能促進細胞成脂分化，增強脂肪代謝；阻斷ERK 1/2抑制脂肪形成；阻斷JNK則刺激脂肪分解，促進細胞凋亡。另外，P38 MAPK還具有促進肌細胞成肌分化，抑制其增殖的作用。Lee等[38-39]研究證實，肌細胞增殖過程中，添加c9, t11-CLA能增加細胞ERK 1/2和JNK的磷酸化水平，增加細胞分化過程中ERK 1/2的磷酸化水平，說明CLA可能通過影響MAPK通路中關鍵蛋白來調節肌細胞的增殖和分化。

Notch通路在調節骨骼肌發育和再生中起關鍵作用，Bi等[40-41]發現，Notch1通過激活效應基因Hes5，來調節豬骨骼肌衛星細胞增殖并維持細胞狀態；激活Notch信號通路能促進肌細胞增殖，但抑制肌細胞分化。有報道顯示，Notch通路還能調控肌肉糖代謝[42]。目前未見關于CLA對肌細胞中Notch通路影響的相關報道，但添加CLA能顯著提高肌肉中棕櫚酸的含量[14]，而體外試驗證實棕櫚酸能提高肌細胞趨化因子配體1(CXCL1)表達水平，敲除CXCL1可減少肌細胞增殖，顯著降低Notch蛋白質水平，因此推測，CLA可能是通過影響肌肉中其他脂肪酸含量變化來調控Notch信號通路的[43]。

4 結 論

豬飼糧中持續添加1.5% CLA可以顯著改變背肌和腿肌組織miRNA的表達，背肌和腿肌組織中共得到16個差異表達的miRNAs，且其靶基因顯著富集到24個信號通路，包括MAPK信號通路和Notch信號通路，提示CLA可通過改變肌肉miRNA表達調控肌肉重要代謝通路，進而影響豬肌肉生長發育。