正交試驗優選白藜蘆醇納米囊泡處方

華芳

(安徽新華學院藥學院，安徽農業大學，安徽 合肥 230000)

王國平,施伶俐

(安徽新華學院藥學院，安徽 合肥 230000)

白藜蘆醇(Resveratrol)作為一種蒽醌萜類化合物，廣泛存在于天然植物中，如葡萄、虎杖等，具有抗炎、抗氧化、抗自由基等作用[1～5]，而白藜蘆醇在實際應用中存在的缺陷有：①水溶性低，口服吸收差，生物利用度低。②在光、熱和氧化劑的作用下容易被氧化降解；在一定程度上限制了白藜蘆醇在醫藥和食品等行業中的應用[6,7]。針對白藜蘆醇的口服吸收差和易被氧化降解的缺陷，尋找溫和、不良反應小的藥物劑型來改善白藜蘆醇的水溶性和降低氧化降解，提高其生物利用度具有非常重要的意義[8]。目前，提高難溶性藥物的藥劑學手段有納米囊泡、納米混懸劑、微乳技術、分子包合技術、脂質體技術、固體分散體等，其中納米囊泡可作為水溶性差的藥物載體，是一種具有組織相容性、細胞透過性的新型給藥系統，可將親水性或親脂性藥物包裹于其中，穩定性較高，不易被氧化或水解。因此，本實驗以聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)作為載體材料，制備復合納米囊泡，以期通過載體材料的性質提高白藜蘆醇的穩定性，擴大其應用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紅外光譜儀：Thermo公司

旋轉蒸發儀：上海貝凱生物化工設備有限公司

Waters Acquity UPLC H-Class 超高效液相色譜系統：美國Waters 公司

1.2 試藥

白藜蘆醇：薩恩化學技術(上海)有限公司(質量分數：98%)。

白藜蘆醇標準品：上海源葉生物科技有限公司(批號：R02J6S1)。

單甲氧基聚乙二醇(MePEG)：薩恩化學技術(上海)有限公司(Mr=2000)。

二環己基碳二亞胺(DCC)：國藥集團化學試劑有限公司。

4-二甲氨基吡啶(DMAP)：阿拉丁試劑責任有限公司。

色譜純甲醇、乙腈：Merck公司。

其余均為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 納米材料的合成

根據洪偉勇[9]等的合成方法進行改良合成。

1)聚乙二醇氰基乙酸酯(MePEGCA)的合成 將氰基乙酸、MePEG、DMAP適量加入三口瓶中，氮氣保護下，抽真空，加入無水二氯甲烷，攪拌溶解后，將溶有DCC的無水二氯甲烷注入三口瓶中，室溫攪拌24 h。抽濾，無水二氯甲烷洗滌濾渣，合并濾液，真空減壓濃縮，旋干至半固體，緩慢倒入3倍量的乙醚攪拌至溶解，-20℃過夜重結晶析出沉淀，得淺黃色固體，即為MePEGCA，真空干燥箱中干燥。

2)十六烷基氰基乙酸酯(HDCA)的合成 將氰基乙酸，十六醇及DMAP適量加入到的三口瓶中，氮氣保護下，抽真空，加入無水二氯甲烷，攪拌溶解后，將溶有DCC的無水二氯甲烷注入三口瓶中，室溫攪拌24 h。正己烷抽濾，洗滌濾液，濾液真空減壓濃縮，旋干至半固體，即為十六烷基氰基乙酸酯黃色粗品，經柱層析分離，得十六烷基氰基乙酸酯白色固體，真空干燥箱中干燥。

3)聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)的合成 將HDCA和MePEGCA加入三口瓶中，氮氣保護下抽真空，加入20mL無水二氯甲烷和無水乙醇，攪拌至溶解后，將甲醛和吡咯烷緩慢注入三口瓶中，氮氣保護下，室溫攪拌24 h。真空減壓旋干，加入10%鹽酸溶液攪拌洗滌，無水二氯甲烷萃取三次，再用水洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，真空減壓濃縮，旋干得淡黃色蠟狀固體PEG-PHDCA粗品，經柱層析分離，得淡黃色蠟狀固體PEG-PHDCA，真空干燥箱中干燥。

2.2 正交試驗優選白藜蘆醇納米囊泡處方

圖1 PEG-PHDCA的紅外譜

1)白藜蘆醇納米囊泡的制備 采用薄膜分散水化超聲法制備：稱取司盤60(span 60)50mg、白藜蘆醇、膽固醇、PEG-PHDCA適量，置于圓底燒瓶中，加入氯仿/甲醇(V∶V=2∶1)混合溶液20mL，超聲溶解后，放入幾枚玻璃小珠，真空減壓旋干至半固體，真空干燥過夜。攪拌條件下加入水相30mL并在65 ℃下水化1h，超聲乳化8h(5min/次)后過濾，即得。

2)白藜蘆醇含量測定 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱( 100mm×2.1mm，1.7 μm) ；流動相為0.05%磷酸水溶液-乙腈(70∶30)；流速：0.2mL/min；檢測波長：306nm；柱溫：30℃；進樣量：1μL。

由色譜圖可得，白藜蘆醇tR為2.841 min(如圖2所示)。

精密稱取白藜蘆醇對照品適量，用甲醇溶解，分別配制成22.0、44.0、66.0、88.0、110.0、132.0、154.0、176.0μg/mL的對照品液，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過后進樣。以色譜峰峰面積(A)為縱坐標，白藜蘆醇質量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=17523C-34411(r=0.9993)。結果表明，白藜蘆醇在22.0～176.0μg/mL范圍內與峰面積值呈良好的線性關系。

圖2白藜蘆醇納米囊泡的UPLC色譜圖(A白藜蘆醇對照品， B白藜蘆醇納米囊泡)

表1 L9(34)正交設計因素水平表

取線性范圍內的3種濃度，分別進行精密度、穩定性、重復性試驗，結果顯示RSD(%) <5%，表明本實驗方法穩定可靠。

3)白藜蘆醇微囊包封率和載藥量的測定 取納米囊泡溶液適量，置截留分子量為10k的超濾管中，6000r/min離心10min，取超濾上清液注入測定游離藥物量。另取納米囊泡溶液適量加入乙腈溶解(V∶V=1∶3)，離心取上清液注入測定藥物總量。按下式計算包封率和載藥量：

包封率%=[(白藜蘆醇納米囊泡中藥物總量-未被包封的游離藥物量)/白藜蘆醇納米囊泡中藥物總量]×100%

載藥量%=(投藥量×包封率/白藜蘆醇納米囊泡總質量)×100%

4)正交試驗優選處方 在前期預試驗基礎上，以投藥量(A)、膽固醇用量(B)、PEG-PHDCA(C)為影響因素，選取載藥量和包封率的綜合評分(綜合評分=0.5×載藥量+0.5×包封率)為評價指標，確定正交試驗方案，因素與水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表 2 正交試驗結果

表3 方差分析表

F0.05(2,2) = 19.00; F0.01(2,2) = 99.00

由表2和表3中得出，白藜蘆醇納米囊泡處方影響因素的主次順序：A>C>B，即投藥量對白藜蘆醇納米囊泡制備的影響最大，PEG-PHDCA次之，膽固醇用量影響最小。白藜蘆醇納米囊泡制備的最佳工藝條件為 A3B1C1，即：投藥量為15mg，膽固醇用量為10mg，PEG-PHDCA用量為20mg。

5)驗證性試驗 按上述最佳工藝條件，進行驗證試驗，白藜蘆醇納米囊泡的平均包封率(92.74 ± 0.27)%，載藥量(14.64 ± 0.04)%。

3 討論

本實驗在囊材的合成中MePEGCA和HDCA是最常見的酯化反應，反應中需要脫去水分，所以開始實驗前需要對試劑及儀器進行干燥處理，達到盡可能的無水。為了提高合成PEG-PHDCA產量和純度，在前兩步的MePEGCA和HDCA合成中需要進行一定的純化處理。白藜蘆醇納米囊泡的制備中發現超聲乳化時間對粒徑有較大的影響，通過對比發現超聲乳化8 h的粒徑會遠遠小于超聲乳化6h。本實驗中未對改造后的白藜蘆醇納米囊泡的釋藥及藥理活性等進行考察，后期需要進一步研究探討。