母胎亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態性與不明原因習慣性流產發生風險的相關性研究

李乾，常亮，劉平，劉娟，路建波,高華方，馬旭

(1.國家衛生計生委科學技術研究所國家人類遺傳資源中心，北京 100081；2.北京大學第三醫院婦產科生殖醫學中心，北京 100191)

習慣性流產(recurrent pregnancy loss，RPL)是指2次或2次以上的自然流產(約70%孕期不滿12周流產)，國際上多稱之為復發性自然流產，臨床發病率約2%～5%[1]。RPL發生的病因非常復雜，大致包括遺傳因素[2]、自身免疫[3]、組織結構因素[4]、感染因素[5]、內分泌因素[6]和其他因素[7]，但仍然有50%～70%的RPL患者無法明確原因[8]，稱為不明原因習慣性流產(unexplained recurrent pregnancy loss，URPL)。研究表明亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因多態性通過影響血清同型半胱氨酸(Hcy)水平及DNA甲基化而造成URPL[9]，但還存在一定的爭議[10]。本研究擬納入URPL及有正常妊娠史的女性及胎兒，探究母體及胎兒自身MTHFR基因C677T多態性與URPL的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選取2014年12月至2016年12月在北京大學第三醫院婦產科生殖醫學中心就診的URPL患者100名為病例組。納入標準：年齡≤40歲、流產史≥2次；排除標準：染色體異常、抗核抗體陽性、妊娠高血壓、糖尿病史、抗心磷脂抗體陽性、甲狀腺功能異常、生殖系統解剖畸形、五種胎兒致畸病毒(TORCH)感染陽性、配偶生殖功能異常等患有明確引起流產的疾病。同時，100名URPL患者中收集到了配對的70例流產胎兒絨毛組織(均為9～13周內，胚胎發育停滯，行清宮術取樣)。另征集100名有正常妊娠史的健康志愿者作為對照組，其中70例有胎兒臍帶血樣本。

本研究開始前經北京大學第三醫院生殖倫理委員會審查批準(編號2015SZ-025)，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣本采集：(1)病例組樣本采集：胚胎發育停滯患者，行常規負壓吸引清宮術，無菌條件下留取絨毛組織2 cm×2 cm，生理鹽水充分漂洗，放入無菌器皿中；同時抽取患者外周靜脈血2 ml，枸緣酸鈉抗凝管-80℃保存。(2)對照組樣本采集：胎兒娩出后，常規斷臍，臍靜脈穿刺取臍帶血，本研究留臍帶血2 ml，枸緣酸鈉抗凝管-80℃保存；同時抽取產婦外周靜脈血2 ml，枸緣酸鈉抗凝管-80℃保存。

2.基因分型檢測方法：基因檢測采用BaiO?核酸提取試劑(上海百澳科技)提取血液及絨毛組織基因組DNA，采用BaiO?MTHFR(C677T)基因檢測試劑盒[上海百澳科技，PCR-芯片雜交法國食藥監械(準)字2012第3401329號]檢測MTHFRC677T 基因多態性位點，操作按說明書進行。血樣本加蛋白酶K短暫離心，加入200 μl緩沖液BL，500 r/min低速離心15 s，裂解細胞，活化吸附柱后轉移至吸附柱中，洗脫獲得DNA。PCR擴增時向擴增液中各加入1 μl反應液(冰上操作)。向擴增液中加入2 μl對應樣本的模板DNA(冰上操作)，低速離心混勻。運行擴增程序：50℃ 5 min，94℃5 min，(94℃ 25 s，56℃ 25 s，72℃ 25 s)，72℃5 min。最后芯片雜交顯色。

三、統計學處理

采用SPSS 22.0統計數據包進行兩組間基因型、等位基因頻率進行分析。URPL病例組與對照組兩組間等位基因頻率采用χ2檢驗進行分析；兩組間母體-胎兒同時攜帶T等位基因頻率采用Fisher精確檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、URPL病例組與對照組MTHFR C677T位點基因型及等位基因頻率比較

基因型頻率統計結果提示，對照組C/C基因型頻率顯著高于病例組C/C基因型頻率(P<0.05)，兩組C/T基因型頻率比較無顯著性差異(P>0.05)；病例組T/T基因型頻率顯著高于對照組T/T基因型頻率(P<0.05)；另外病例組等位基因T頻率顯著高于對照組基因T頻率，且病例組中等位基因T頻率顯著高于基因C頻率，而對照組等位基因C頻率顯著高于病例組基因C頻率(P<0.05)(表1)。

表1 URPL病例組和對照組MTHFR C677T基因型頻率及等位基因頻率比較結果[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

二、URPL病例組與對照組配對母體-胎兒同時攜帶MTHFR 677位T等位基因比較

URPL病例組配對的母親和胎兒至少有一個為C/C基因型的配對組有18對，頻率為25.7%；配對的母親和胎兒同時攜帶T等位基因(即基因型C/T或T/T)的配對組有52對，頻率為74.3%。對照組配對的母親和胎兒至少有一個為C/C基因型的配對組有33對，頻率為47.1%；配對的母親和胎兒同時攜帶T等位基因(即基因型C/T或T/T)的配對組有37對，頻率為52.9%。病例組和對照組配對的母親和胎兒同時攜帶T等位基因的頻率差異有統計學意義(Fisher精確檢驗，P=0.014)，病例組顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 URPL病例組和對照組母體-胎兒同時攜帶MTHFR 677位T等位基因頻率比較結果[n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

流行病學發現，復發性流產發生率約占全部妊娠的2%～5%[1]。除明確的遺傳因素、自身免疫、組織結構因素內分泌因素和其他因素外，約有一半以上的患者發病原因仍然不明[11]。該疾病給家庭帶來巨大的精神壓力和經濟壓力，成為近年來的研究熱點。

既往研究發現MTHFRC677T多態性與URPL可能存在相關性[12-14]。MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵性的酶，對5，10-亞甲基四氫葉酸還原成為5-甲基四氫葉酸起催化作用。MTHFR基因677位等位基因C變為T會導致MTHFR酶耐熱性和活性下降甚至喪失，酶活性降低會導致5-甲基四氫葉酸合成減少，5-甲基四氫葉酸為Hcy提供一碳單位使其甲基化為甲硫氨酸，5-甲基四氫葉酸合成減少使Hcy不能甲基化為甲硫氨酸而造成Hcy堆積，導致血清Hcy水平升高[15-16]。Hcy具有細胞毒性可以使巰基氧化，細胞內產生大量氧自由基，損傷血管內皮并增加血栓形成風險，影響子宮胎盤血流灌注，導致胚胎血液供給不足影響生長發育從而使流產風險升高[17]。另外，MTHFR酶活性降低影響甲硫氨酸合成效率，導致甲基供給異常，出現DNA甲基化不足和DNA合成障礙，胚胎發育期甲基化異常導致胚胎正常發育失敗，最終將導致出生缺陷或者胚胎停育[18-19]。

高Hcy血癥可能是URPL的風險因子之一，但由于本研究納入的URPL組中的部分患者已服用葉酸進行治療，入組本研究時患者的血清Hcy水平已經大幅度降低。此外，影響血清Hcy水平的因素很多，包括年齡、性別、BMI[20]、飲食中是否攝入含大量蛋氨酸的食物[21]等，Hcy一次的檢測結果難以反映患者妊娠時真實的水平。因此，本研究未將病例及對照Hcy水平納入研究，而是關注URPL組與對照組MTHFR基因 C677T位點基因分型，結果顯示URPL組中MTHFRC677T位點T等位基因頻率顯著高于對照組，支持MTHFRC677T位點T等位基因是URPL的高風險因子。

目前，胎兒本身的MTHFRC677T等位基因是否與URPL相關的研究比較少見，曾有報道認為夫妻配對研究可以間接地反映子代MTHFRC677T基因型，王亞文等[22]對32對有兩次及兩次以上URPL史的夫婦和39對健康夫婦進行MTHFRC677T相關性研究，結論認為子代攜帶MTHFR純合或雜合突變可能是胚胎早期發育異常的原因之一，從而導致流產的發生。顧瑩等[23]對URPL組和對照組各50對夫婦的外周血進行MTHFRC677T的位點多態性進行檢測分析本研究結果顯示，夫婦雙方T等位基因頻率在URPL組顯著升高。本研究直接檢測與母體配對的流產胎兒組織樣本，分析結果顯示配對的母體和胎兒均攜帶T等位基因時，URPL風險進一步升高。推測其原因，一方面母親攜帶T等位基因，自身MTHFR酶活性降低，易發生Hcy堆積而使胎盤形成血栓風險升高，影響胚胎血液供給；另一方面胎兒自身攜帶T等位基因時，高Hcy產生細胞毒性，激發某些信號轉導途徑和控制系統，誘發細胞凋亡，影響胚胎早期重要的心臟、神經系統等的發育。因此，母體和胎兒均同時帶T等位基因增加了URPL風險，進一步推測，對于夫妻雙方均攜帶有T等位基因時，鑒于其遺傳給胎兒的幾率較大，因此應該密切關注其可能流產的風險。

綜上所述，本研究的結果顯示MTHFR677位 T等位基因是URPL的風險因素之一，為MTHFRC677T基因型與URPL相關性研究提供了一定的實驗依據和資料積累。但是，本研究URPL病例組和對照組樣本數量較少，日后還需要積累更多樣本量繼續驗證工作。本研究的結果提示對于無法尋找出原因的習慣性流產患者，建議進行MTHFRC677T基因型的篩查，同時，如果有條件獲取胎兒MTHFRC677T基因型時，應該密切關注母胎均攜帶MTHFR677位T等位基因的孕婦流產風險，并后續有針對性地進行預防和治療。