乙醇誘導的柞蠶絲素蛋白多孔材料的研究

王心如， 鄒盛之， 馮文慶， 張耀鵬， 張佳明， 邵惠麗

(1.東華大學 a.纖維材料改性國家重點實驗室; b.材料科學與工程學院，上海 201620；2．復旦大學附屬華山醫院 老年科，上海 200040)

生物醫用材料是一類與生命系統相作用，用以診斷、治療、修復和替代人體病變或損傷的組織、器官，或增進其功能的材料[1]。目前，正在研究及已得到應用的生物醫用材料很多，例如硅橡膠、膠原蛋白、甲殼胺、尼龍、聚酯等，它們各有其特點，但有些合成材料的生物相容性不足，有些天然材料則提純比較困難，成本較高[1-2]。

相比之下，天然蠶絲是一種容易獲得且價格相對便宜的生物材料，由于其具有優良的柔韌性、吸濕性、透氣性和優雅的光澤而被人們熟知。蠶絲中含有生物相容性良好的絲素蛋白，而絲素蛋白自身及降解產物對細胞和機體無毒，不會或較少引起炎癥和免疫排斥反應，從而使得蠶絲在生物醫學領域的研究得到迅速發展。蠶絲可分為家蠶絲與野蠶絲兩大類，家蠶絲主要指桑蠶絲，野蠶絲則包括柞蠶絲、天蠶絲、蓖麻蠶絲等，其中柞蠶絲在我國資源豐富、分布廣闊。目前，中國柞蠶繭每年產量占世界總產量的90%左右[3]。近年來，人們對蠶絲絲素蛋白的研究逐漸轉向分子水平。通過研究發現，柞蠶絲中的絲素蛋白(ASF)具備一般蠶絲絲素蛋白所不具備的優點，即ASF中含有大量的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽序列，經證明該序列對細胞的黏附有利[4]，因此，利用ASF制備的生物組織工程支架在醫學領域中有較大的應用前景。

為了制備ASF多孔組織工程支架材料，冷凍干燥技術是一種環境友好、經濟高效的成型方法。但研究發現，經冷凍干燥法直接得到的ASF材料是溶于水的，尚無法有效應用于生物醫學領域。人們在對家蠶絲素蛋白(BSF)的研究中發現，采用某些方法可使絲素蛋白構象轉變，從而使制備的材料不溶于水。其中，用乙醇處理是最簡單和可靠的方法。目前，有些研究小組已報道了乙醇影響BSF構象的研究結果[5-7]。然而，國內外尚未見報道在溶液中直接加入乙醇誘導ASF成膠、再冷凍干燥制備ASF多孔材料。

為此，本研究以柞蠶絲為原料，采用乙醇促使ASF溶液快速凝膠并進一步冷凍干燥的方法制備ASF多孔材料，然后通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、掃描電子顯微鏡(SEM)探討了乙醇水溶液濃度及ASF初始濃度對ASF樣品結構的影響。采用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對ASF多孔材料的生物相容性進行初探，本研究有望對制備性能優良的ASF組織工程支架材料提供一定的理論指導。

1 實 驗

1.1 材 料

柞蠶絲，購自遼寧丹東(市售)。無水碳酸鈉(Na2CO3)(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，硫氰酸鋰(LiSCN)(分析純，西格瑪奧德里奇有限公司)，纖維素透析袋(截留相對分子質量為14 000±2 000)(上海源聚生物科技有限公司)，無水乙醇(分析純，江蘇常熟市鴻盛精細化工有限公司)，雪旺細胞(SCs細胞株)(中國科學院生物化學與細胞生物學研究所)，鬼筆環肽(Alexa Fluor?568 phalloidin)(英杰生命科技有限公司)，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

MDF-192型超低溫冰柜(日本SANYO公司)，FD-1A-50型冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)，Nicolet 8700型傅里葉變換紅外光譜(美國熱電公司)，JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子株式會社)，TCS SP5 Ⅱ型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國徠卡公司)。

1.3 再生柞蠶絲素蛋白水溶液的制備

將柞蠶絲放入質量分數0.5%的Na2CO3水溶液中，浴比1︰50，在100 ℃下脫膠30 min，重復該過程3次，用去離子水充分洗滌，然后干燥獲得脫膠絲。將脫膠絲以1︰10的浴比在50 ℃下溶解于9.0 mol/L的LiSCN水溶液中，經離心過濾后將濾液裝入纖維素透析袋，在4 ℃下用去離子水透析后進一步濃縮形成初始質量分數分別為4%、6%、8%和10%的再生ASF水溶液，并將它們分別等體積置于不同的燒杯中待用。

1.4 再生柞蠶絲素蛋白多孔材料的制備

向上述各種質量分數的再生ASF水溶液中以1︰1的體積比分別加入70%、80%、90%和100%的乙醇水溶液或純乙醇，將混合溶液于4 ℃下靜置使其形成凝膠后，采用MDF-192型超低溫冰柜在-50 ℃下對其進一步冷凍24 h，然后采用FD-1A-50型冷凍干燥機進行減壓干燥，得到再生ASF多孔材料(簡稱ASF凍干樣品)。

1.5 再生柞蠶絲素蛋白樣品結構與性能的表征

采用Nicolet 8700型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀，通過ATR法對再生ASF凝膠及其冷凍干燥后樣品的二級結構進行表征。測定波數范圍為4 000～525 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次。

上述樣品的FTIR譜圖的酰胺Ⅰ區(1 600～1 700 cm-1)中，各子峰與絲素蛋白二級結構的對應關系如下[8-10]：1 600～1 640 cm-1為β-折疊構象，1 640～1 660 cm-1為α-螺旋或無規線團構象，1 660～1 690 cm-1為β-轉角構象。按文獻[11]所述方法用Peakfit軟件采用高斯函數對樣品譜圖進行曲線擬合，根據歸一化后各子峰的積分面積計算ASF樣品中對應的二級結構相對百分含量。

采用JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)在10 kV電壓下對表面經噴金處理的ASF凍干樣品的形態進行觀察及拍照，并用圖像處理軟件(Nano Measurer)分析電鏡照片中100個孔的尺寸，由此得到樣品的平均孔徑及孔徑分布。

參考文獻[12]方法，在再生ASF多孔材料(ASF水溶液初始質量分數為6%，乙醇誘導采用純乙醇)上接種雪旺細胞(SCs)，培養第4天后用鬼筆環肽和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察接種在多孔材料上的細胞形貌。

2 結果與分析

2.1 乙醇誘導柞蠶絲素蛋白結構轉變的二級結構分析

ASF分子的二級結構主要包括β-折疊構象、α-螺旋構象和無規線團構象，另外還有部分的中間態構象(即β-轉角構象)[13-14]。圖1是不同ASF樣品的FTIR圖譜。其中，圖1(a)為天然柞蠶絲經脫膠后的樣品結果，從圖中可以發現，脫膠柞蠶絲在1 625 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 520 cm-1(酰胺Ⅱ)、1 237 cm-1(酰胺Ⅲ)、962 cm-1(酰胺Ⅳ)和700 cm-1(酰胺Ⅴ)處的吸收峰均屬于絲素蛋白β-折疊構象[15-16]，621 cm-1(酰胺Ⅴ)處的吸收峰則屬于α-螺旋構象[17]。由此可見，脫膠柞蠶絲樣品的二級結構以β-折疊構象為主。

圖1 不同ASF樣品的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of different ASF samples

圖1(b)反映的是初始質量分數為4%的再生ASF水溶液的紅外結果。考慮到乙醇處理過程是在其中以1︰1的體積比加入乙醇或乙醇水溶液，混合溶液中ASF的質量分數會下降至2%左右，為了便于比較分析，圖1(c)進一步給出了2%再生ASF水溶液的FTIR結果。可以發現，圖1(b)與圖1(c)具有相同的出峰位置，其中1 645 cm-1(酰胺Ⅰ)處較尖銳的峰是絲素蛋白無規線團/α-螺旋構象所致[18-19]，而700 cm-1(酰胺Ⅴ)處屬于β-折疊構象的峰相對較弱。由此可見，與上述脫膠柞蠶絲相比，再生ASF水溶液中β-折疊構象要少得多。

圖1(d)是乙醇誘導ASF水溶液所形成的凝膠的FTIR圖譜，較明顯看出，該譜圖的吸收峰位置和脫膠柞蠶絲樣品(圖1(a))的紅外吸收峰位置類似，1 630 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 522 cm-1(酰胺Ⅱ)、1 241 cm-1(酰胺Ⅲ)、965 cm-1(酰胺Ⅳ)和700 cm-1(酰胺Ⅴ)處是絲素蛋白β-折疊構象的典型吸收峰，621 cm-1(酰胺Ⅴ)處為絲素蛋白α-螺旋構象的吸收峰。從紅外光譜變化來看，乙醇誘導溶液成膠后，ASF凝膠的紅外譜圖(圖1(d))出現了明顯的β-折疊構象的吸收帶。對圖1(b～d)曲線的酰胺Ⅰ區按文獻[8]提及方法進行分峰處理，可得到各樣品中不同二級結構的含量，其中2%和4%再生ASF水溶液中的β-折疊構象含量分別僅為10.9%和13.0%，而添加乙醇后得到的凝膠中β-折疊構象的含量升至26.5%，這表明ASF溶液在乙醇的誘導作用下形成凝膠后，部分ASF分子由原來的α-螺旋/無規線團構象轉變成了β-折疊構象。

圖1(e)是上述ASF凝膠冷凍干燥后樣品的FTIR圖譜。由圖1(e)可知，該樣品紅外光譜的出峰位置和圖1(d)基本一致，但酰胺Ⅰ區屬于β-折疊構象的吸收帶略往低波數方向移動至1 624 cm-1處。據文獻[20]報道，酰胺Ⅰ區(1 600～1 700 cm-1)的產生主要由C—O伸縮振動貢獻，且易受到氫鍵效應的影響。氫鍵的產生會引起伸縮振動頻率向低波數方向偏移，由此說明了ASF凝膠冷凍干燥得到的ASF樣品中含有更多的氫鍵。定量分析結果顯示，ASF凍干樣品中β-折疊構象含量也更高，這可能是因為在ASF凝膠冷凍干燥過程中，冰晶會對絲素蛋白產生類似剪切的作用而誘導絲素蛋白由α-螺旋/無規線團構象向β-折疊構象轉變[21-22]，使得ASF樣品中形成更多的分子間氫鍵。因此，與ASF凝膠相比，ASF凍干樣品在酰胺Ⅰ區的吸收帶略往低波數方向移動(更接近于脫膠柞蠶絲)。

2.2 乙醇水溶液濃度對ASF凝膠及其凍干樣品二級結構的影響

根據本研究中FTIR測試結果并結合文獻[23-25]，一方面，在ASF水溶液中加入乙醇會使乙醇分子更多地與水分子結合，破壞水分子與絲素蛋白分子的結合，從而使得絲素蛋白分子之間的相互作用增強，導致絲素蛋白分子間形成更多的氫鍵，生成更多β-折疊構象。另一方面，ASF富含聚丙氨酸序列，該序列表現出很強的疏水性。而乙醇分子中的乙基與ASF中丙氨酸鏈段的結構較為相似，推測能與其相似相溶，故在ASF水溶液中加入乙醇后，絲素蛋白的疏水基團與乙醇分子的相互作用逐漸增強，削弱了絲素蛋白分子在疏水區域之間的相互作用，促進了這些疏水鏈段的活動，從而導致絲素蛋白從高能量的無規線團/α-螺旋構象轉變為低能量的β-折疊構象。當β-折疊構象的含量增加到某個臨界值時，ASF水溶液中就出現了不溶物，隨著不溶物尺寸和數目不斷增多，體系的流動性逐漸變差，最終形成凝膠。

研究表明，在正常情況下ASF凝膠過程十分緩慢，將低質量分數(如4%或2%)的ASF水溶液置于4 ℃的溫度下，經過兩周仍無凝膠現象產生。而在與一定量的乙醇作用后，即有部分絲素蛋白變性成白色絮狀物，這些白色絮狀絲素蛋白就是前述的不溶物。當水溶液中ASF含量一定時，隨著乙醇濃度的提高，溶液中出現的白色絮狀物增多，凝膠過程也大幅加速。當乙醇濃度僅為70%時，體系完全形成凝膠的時間需20 h以上；當乙醇濃度上升至80%及90%時，溶液中出現白色絮狀物的速度加快，且凝膠時間分別縮短至7 h和5 h；而當乙醇濃度達到100%時，溶液中很快出現白色絮狀物，凝膠時間僅需3 h。

圖2反映了乙醇水溶液濃度對ASF凝膠及其凍干樣品二級結構的影響。在不同乙醇濃度下，ASF凝膠中β-折疊構象含量均比其進一步冷凍干燥后的樣品低，這再次佐證了上一節的相關結論。從圖2中a曲線還可以看出，乙醇濃度的增加能使ASF凝膠中β-折疊構象的含量增多。這是因為溶液中乙醇濃度越高，有越多的乙醇分子會與水分子結合，從而破壞水分子與絲素蛋白分子結合，導致絲素蛋白分子之間的相互作用增強，這種情況下形成β-折疊構象的速度更快，凝膠中β-折疊構象的含量相對更多。此外，乙醇濃度越高意味著有更多的乙醇分子會與絲素蛋白的疏水基團發生相互作用，使得疏水鏈段的活動能力加快，從而導致更多的無規線團/α-螺旋構象轉變為β-折疊構象。

圖2 乙醇水溶液濃度對ASF凝膠及其進一步凍干后樣品的二級結構的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the secondary structure of ASF gel and freeze-dried ASF samples

從圖2中b曲線進一步可以看出，ASF凝膠冷凍干燥后的樣品也有類似的結果，當乙醇水溶液濃度從70%上升至100%時，ASF凍干樣品中β-折疊構象的含量從29.6%增加至36.5%。由此可見，提高乙醇誘導過程中采用的乙醇水溶液濃度，將促進冷凍干燥法ASF材料中β-折疊構象的形成。

2.3 ASF初始質量分數對ASF凝膠及其凍干樣品二級結構的影響

圖3反映了ASF初始質量分數對ASF凝膠及其進一步凍干后樣品二級結構的影響，可以發現，當ASF初始質量分數從4%上升至10%時，ASF凝膠中的β-折疊構象含量(圖3(a))從26.5%提高到33.0%，而α-螺旋/無規線團構象含量則從54.7%降至43.9%，這說明ASF初始質量分數的增加有利于凝膠中β-折疊構象的形成。ASF初始質量分數越高，越能減少絲素蛋白分子與水分子結合的幾率，使得絲素蛋白分子鏈相互碰撞的機會更大，絲素蛋白分子之間的相互作用也更強。

圖3 ASF初始質量分數對ASF凝膠及其進一步凍干后樣品二級結構的影響Fig.3 Effect of original ASF concentration on the secondary structure of ASF gel and freeze-dried ASF samples

隨著絲素蛋白分子間相互作用的增強，ASF水溶液成膠的過程中形成β-折疊構象的速度將變快，從而導致β-折疊構象的含量更多。ASF初始質量分數對ASF凝膠進一步凍干后樣品二級結構的影響也有類似的結果(圖3(b))，當ASF初始質量分數從4%上升至10%時，ASF凍干樣品中β-折疊構象的含量隨之從36.5%提高至46.1%，而α-螺旋/無規線團構象的含量則從42.0%降至33.5%。由此可見，ASF水溶液質量分數的適當提高，有利于冷凍干燥法ASF材料中絲素蛋白構象向β-折疊構象轉變。

2.4 ASF初始質量分數與乙醇水溶液濃度對ASF凍干樣品微觀結構的影響

由前述可知，ASF凝膠中β-折疊構象含量已明顯高于ASF水溶液，但仍不占主導地位，這導致凝膠結構不是非常穩定。因此，在對ASF樣品進行形態結構分析時，主要采用由凝膠進一步冷凍干燥處理后的樣品。圖4為由不同初始質量分數的ASF水溶液制得的ASF凍干樣品橫截面的SEM照及對應的孔徑分布結果，從中可以看出，ASF水溶液初始質量分數為4%時，樣品截面中空隙形態大體呈無規則(故無法分析其孔徑分布，圖4(a)中無所對應的孔徑分布圖)，這可能是由于ASF質量分數較低使得材料強度不高，導致制樣及測試中材料形態易被破壞。而當溶液中ASF含量逐漸增大時，樣品截面的形態也變得更有規則，逐漸呈現孔狀結構。從圖4(b～d)右側所對應的各樣品孔徑分析結果可以進一步發現，ASF水溶液的初始質量分數從6%上升至10%時，樣品的平均孔徑從30.4 μm減小至18.8 μm。這可能是因為溶液中ASF含量較高時，冷凍過程中ASF分子對水分子運動的阻力較大，不利于形成大的冰晶，故所制得的ASF多孔材料的孔徑相對較小。

圖4 由不同質量分數的ASF水溶液制得的ASF凍干樣品橫截面的SEM照片及對應的孔徑分布Fig.4 SEM images and pore size distribution histograms of freeze-dried ASF samples prepared from ASF aqueous solution with different concentrations

圖5進一步給出了采用不同濃度的乙醇水溶液誘導制得的ASF凍干樣品橫截面的SEM照片。由圖5可知，隨乙醇水溶液濃度的增加，ASF樣品的平均孔徑呈一定的上升趨勢。由文獻[26-27]可知，孔徑在10～20 μm的微小孔洞能基本滿足細胞黏附及生長因子、營養物質通過的要求，孔徑介于20～100 μm的多孔材料在動物表皮細胞培養及載入生長因子方面具有一定的應用前景[28]，而更大孔洞則有利于細胞生長[29]。因此，為了驗證所制備的ASF多孔材料能否滿足細胞黏附、生長的需求，本研究進一步考察了其生物相容性。

2.5 再生柞蠶絲素蛋白多孔材料的生物相容性評價

選擇ASF質量分數為6%、純乙醇誘導作為優選條件來制備多孔材料。細胞在材料上的生長數目和形態可直觀體現生物相容性。圖6顯示了SCs在ASF多孔材料和蓋玻片材料上接種4 d后的激光掃描共聚焦顯微鏡圖(采用鬼筆環肽和DAPI分別對細胞的骨架和細胞核進行染色)。從圖6中可以看出，ASF多孔材料和蓋玻片上的細胞生長形態很多是圓形，部分細胞出現了偽足。并且，相比于蓋玻片，SCs在ASF多孔材料上生長得更為密集，細胞數目和偽足更多，這說明ASF多孔材料比蓋玻片更能促進細胞的黏附和生長。因此，本研究所制備的ASF多孔材料可作為組織工程支架應用在生物醫療領域，并具有較大的潛在價值。

3 結 論

本研究以柞蠶絲為原料，采用乙醇促使ASF水溶液快速凝膠并進一步冷凍干燥的方法，制備了ASF多孔材料，得到以下結論：

1)乙醇能誘導ASF水溶液形成凝膠，且形成凝膠的過程中伴隨有大量β-折疊構象的產生。

2)隨乙醇水溶液濃度的升高及ASF水溶液初始質量分數的增加，凝膠中β-折疊含量也相應上升。

3)提高乙醇水溶液濃度或適當降低ASF水溶液初始質量分數，有利于獲得孔徑較大的冷凍干燥法ASF多孔材料。

4)細胞實驗結果表明，本研究所制備的ASF多孔材料可作為組織工程支架應用在生物醫用領域，并具有較大的潛在價值。