腎康靈對TGF-β1干預的腎小管上皮細胞的α-SMA和E-cadherin表達的影響

盧小露 艾斯 鄭健

原發性腎病綜合征（PNS）是一種常見兒科腎臟疾病，患病率為16/10萬[1]，占小兒腎病綜合征的90%左右[2]。PNS也常伴有腎小管間質的變形、萎縮、壞死，最終誘發腎間質纖維化[3]，腎間質纖維化是衡量PNS病情進展關鍵指標之一[4]。我院選用激素聯合腎康靈治療PNS，有效率達88.89%左右，相比單純激素治療，有效率提升顯著[5]。本研究以TGF-β1干預的腎小管上皮細胞為實驗模型，選取α-SMA、E-cadherin為研究指標，探討腎康靈改善腎間質纖維化的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞

大鼠腎小管上皮細胞（貝爾曼公司）。

1.2 藥品和試劑

腎康靈（福建中醫藥大學附屬人民醫院院內制劑，閩藥批號Z06106049；由黃芪、山藥、三七、繡花針等藥物組成）；轉化生長因子 -β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）（PEPROTECH）；β-肌動蛋白（b-actin）和上皮鈣黏蛋白（Epithelial-cadherin，E-cadherin）的PCR引物（武漢生工生物工程公司）；anti-E-cadherin和鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（anti-αsmooth muscle actin，anti-α-SMA）（Cell Signaling）。

1.3 主要儀器

CO2培養箱（Thermo Forma）；PCR擴增儀、凝膠成像系統和轉膜裝置、垂直電泳裝置和轉移電泳裝置（Bio-Rad）；RNA定量儀（PE生物系統公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養、分組

用含10%胎牛血清的1 640培養液培養腎小管上皮細胞，待生長融合至70時，以每孔板1×104/ml密度種至培養皿內，于37℃、5%CO2培養箱中培養，用0.25%胰酶消化，培養7 d以1 : 2傳代。按1×105個/ml密度在25 cm2培養瓶內接種細胞，達到60%左右融合時，使細胞同步化生長24 h后分組。分組情況：正常培養液（空白組）、TGF-β110 ng/ml（TGF-β1組）、腎康靈25 μg/ml+TGF-β110 ng/ml（腎康靈組），分別給藥48 h。

2.2 Western bloting法

細胞用預冷的PBS洗3次，加入含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 rpm、10 min離心，提取總蛋白并測定蛋白濃度。蛋白質變性后經電泳、轉印、封閉，加入抗α-SMA和抗β-actin的一抗中，4℃孵育過夜；洗膜后再加入二抗，室溫孵育1 h；洗膜后加入ECL顯色液，靜置1 min，用凝膠圖象處理系統分析目標條帶的光密度值。

2.3 RP-PCR法

總RNA的提取可根據TRIzoI試劑說明書進行，依照逆轉錄擴增試劑盒操作程序采取cDNA的合成。經對Primers軟件的利用，對目的基因引物予以設計。E-cadherin mRNA引物序列為：5’-GCTGGACCGAGAGAGTTTCC-3’，5’-CAAAATC CAAGCCCGTGGTG一3’，長度155 bp。擴增反應條件：95℃進行預變性15 min，95℃變性45 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共45個循環，最后一次，72℃延伸5 min。反應結束后，實施專用凝膠成像儀成像。實施Image-Lab軟件光密度值統計掃描圖像的目的條帶，分析比較內參基因和目的基因PCR產物的光密度，得出mRNA的相對含量。

3 統計學處理

4 結果

4.1 Western bloting法檢測α-SMA

TGF-β1組α-SMA蛋白的表達相對于空白組明顯上調（P=0.018＜0.05），而腎康靈組α-SMA蛋白的表達水平低于TGF-β1組，與之比較，差異具有統計學意義（P=0.023＜0.05）。結果見圖1。

4.2 RP-PCR法檢測E-cadherin

與空白組比較，TGF-β1組E-cadherin表達降低（P=0.001＜0.05），而腎康靈組E-cadherin表達水平高于TGF-β1組，差異具有統計學意義（P=0.043＜0.05）。結果見圖2。

5 討論

PNS屬于祖國醫學“水腫”“尿濁”范疇[6]，其根本病機為本虛標實，虛實夾雜[7]。腎康靈具有益腎滋陰、行氣化瘀之效。臨床研究證實[8-9]，腎康靈可以改善PNS患兒高凝狀態，又可以調節機體免疫功能，降低感染率，減少PNS的復發。動物實驗發現[5，10]，腎康靈能改善阿霉素大鼠腎臟局部毛細血管通透性與血流動力學，溶解血栓，修復足突，實現保護腎小管間質的效果。PNS頻復發、激素耐藥或病情長期不能緩解時，可刺激促纖維化相關因子和炎性趨化因子釋放，刺激間質成纖維細胞活化，分泌大量細胞外基質成分，形成腎間質纖維瘢痕，最終致腎間質纖維化。TGF-β1是目前最關鍵的促纖維化因子之一，TGF-β1的表達和腎臟纖維化的嚴重程度呈正相關性。在激素耐藥性腎病病理類型為膜增殖性腎病、局灶階段腎小球硬化或最終發展為終末期腎病的病例中，TGF-β1增加[11]。轉分化過程中，腎小管上皮細胞逐步向間質細胞轉化，隨著腎間質纖維化的不斷進展，作為公認的肌成纖維細胞的特征性標志蛋白α-SMA的表達不斷升高[12]。與之相反，E-cadherin廣泛存在于正常的腎小管上皮組織中，而當出現細胞損傷的情況時，其含量則不斷減少。

本實驗中，TGF-β1組α-SMA表達增加，同時E-cadherin mRNA的表達下降，說明其成功誘導了腎間質纖維化的發生。而腎康靈可抑制α-SMA的表達，增加E-cadherin mRNA的表達，證明了腎康靈能夠拮抗TGF-β1引起的腎小管上皮轉分化，減少TGF-β1對腎小管上皮細胞的損傷。

圖1 Western blot法檢測α-SMA

圖2 RP-PCR法檢測E-cadherin

綜上所述，腎康靈能夠通過抑制肌成纖維細胞的特征性標志蛋白α-SMA的表達，增加腎小管上皮細胞分泌的上皮細胞標記物E-cadherin mRNA的表達，抑制轉分化的發生，減輕TGF-β1對腎小管上皮細胞的損害，改善腎臟纖維化，從而達到了保護腎臟的效果。