肝細胞癌相關基因CTNNB1的3號外顯子突變研究*

徐艷 譚維維 胡迅 楊宗澤 樊萍 張姝 席佳蕾 王亞曦

(四川大學華西醫院生物樣本庫，四川 成都 610041)

原發性肝細胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC) 是常見的原發性惡性腫瘤之一，腫瘤相關病死率居全球第二位[1]。HCC的發病率與性別及地域相關，男性發病率為女性的2～4倍，在地域中主要分布在亞洲 (75%) ，其中大約50%發生在中國，中國男性HCC的發病率約為 40.0 /1000000，女性約為15.3 /1000000[2-3]。

HCC的發生發展受環境與遺傳等多因素影響，多年的研究已發現一些腫瘤相關基因在細胞周期調節、細胞生長及粘附等功能中具有重要的作用，可能會引起廣泛的基因組改變并破壞正常細胞信號通路功能，最終導致HCC的發生。其中，癌基因CTNNB1位于3q22.1, 其所編碼的蛋白β-catenin是HCC相關研究中的一個熱點，該基因在HCC中的突變率可達到12.8%～44.4%，突變類型大多為單核苷酸置換和缺失突變，并且集中在其3號外顯子區域[4]。中國人群中相關的研究報導較少，本研究擬對HCC患者的CTNNB1基因3號外顯子突變情況進行測序，并通過免疫組化方法檢測突變患者組織中β-catenin蛋白的表達水平，探討該基因3號外顯子突變與HCC發生的相關性。

1 對象與方法

1. 1 對象及材料 隨機選取四川大學華西醫院已行手術的100例原發性肝細胞癌患者腫瘤組織及配對的遠端正常組織樣本200份。患者均為漢族，其中男85 例，女15例，年齡18～75歲，所有樣本均為手術后取樣分裝立即液氮凍存備用。所有患者均由醫院病理科明確診斷為HCC。本研究經四川大學華西醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 天根生化科技(北京)有限公司血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA。NanoDrop 8000分光光度計測量DNA濃度及純度，A260/A280的比值在1.8～2.0之間時DNA的純度符合PCR擴增要求。

1.2.2 PCR擴增CTNNB1基因3號外顯子 引物序列為F1: 5′-CAATGGGTCAT ATCACA GATTCT -3′，R1：5′-CTAAGTATTTGCTATCCTAAATGGT -3′。PCR擴增體系包括: DNA模板 (25 ng/ml) 2μl、 KOD-Plus-Neo高保真PCR酶 (1.0U/μl) 0.4μl、上下游引物 (10 μmol/L)各0.5μl、Dntp (2 mmol/L) 2μl、MgSO4(25 mmol/L) 1.2 μl、PCR緩沖液2μl，用pH 8.2雙蒸滅菌水補足總體積20μl。94℃預變性2 min；98℃變性10s，55℃退火30s，68℃延伸30s，共35個循環后68℃延伸5 min。擴增產物為466bp片段大小，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCR產物測序及序列分析 PCR擴增產物直接測序，由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。為保證測序結果的可靠性，采用正反雙向測序。基因測序結果使用Chromas軟件和Gene Tool軟件分析，對腫瘤組織、配套正常對照組織測序結果及GENEBANK中所查到的基因標準序列同時進行比對分析，判斷有無突變并分析相應氨基酸的改變情況。

1.2.4 免疫組化檢測突變患者肝癌組織中 β-catenin蛋白的表達 根據測序及序列分析結果，選取已發現有CTNNB1基因3號外顯子突變的患者，對其腫瘤及正常對照組織進行β-catenin蛋白表達檢測。所有標本制備石蠟切片并采用SP免疫組化法進行染色。β-catenin單克隆抗體，SP免疫組化試劑盒和辣根過氧化氫酶二氨基聯苯胺 (diami-nobenzidine，DAB) 顯色試劑盒購自Dako公司 。主要方法如下：組織經中性甲醛固定，石蠟包埋并制成4μ m厚的切片、常規脫蠟和水化后PBS液沖洗3次，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性并 置于pH6.0的枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復；室溫下正常山羊血清阻斷非特異性反應，滴加一抗試劑，4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，滴加生物素標記二抗，室溫孵育后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，室溫下孵育，最后DAB顯色、蘇木素復染、二甲苯透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片在高倍鏡 (×400)下隨機選擇 10 個不重復視野。結合染色強度和陽性細胞百分比綜合判定結果。染色強度為無著色0分，淺黃色1分 ，棕黃色2分 ，棕褐色 3分；陽性細胞百分比<10%計 0分 ，10%～40%計 1分，41%～ 70%計2分 ，≥71%計 3分；將上述兩項得分相加，0～1分為蛋白表達陰性，2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性，其中 2～6分為蛋白表達陽性。

1.3 統計學分析 采用SPSSl8.0統計軟件對CTNNB1基因突變與患者性別、發病年齡、有無乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 感染及腫瘤分化程度等臨床病理特征之間的相關性進行分析。其中，計數資料比較應用四格表卡方檢驗；計量資料比較應用t檢驗或方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1CTNNB1基因3號外顯子突變情況 100例腫瘤組織中3例發生突變，突變率為3%。3例均為雜合錯義突變，1例為CTNNB1外顯子區域第363位堿基出現一個雜合突變 (c.363 A> T)，引起第32位密碼子編碼的氨基酸由天冬氨酸變為了纈氨酸 (p.D32V)，見圖1；另外2例患者均在外顯子區域第375位堿基檢測出同一種雜合錯義突變 (c.375 A> C)，引起第36位密碼子編碼的氨基酸由組氨酸變為了脯氨酸 (p.H36P)，見圖2。這兩種突變均位于既往報道的3號外顯子突變熱點區域。

2. 2 β-catenin蛋白在CTNNB1基因3號外顯子突變患者組織中的表達 對3例檢測到CTNNB1基因3號外顯子突變的HCC患者的腫瘤及配對正常組織進行免疫組化檢測，結果均顯示：β-catenin蛋白在正常肝組織中主要定位于細胞膜，為弱表達；腫瘤組織染色主要定位于細胞膜及胞漿，表達明顯較正常組織增強，為強陽性表達，見圖3。

2.3CTNNB1基因突變與臨床病理特征之間的關系 將3例CTNNB1突變患者歸為一組，無突變者歸為另一組，對患者的性別、發病年齡、有無HBV感染及腫瘤分化程度等臨床表型進行比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1CTNNB1基因雜合錯義突變(c.363A>T，p.D32V)

Figure1Themissensemutations(c.363A>T，p.D32V)ofCTNNB1gene

圖2CTNNB1基因雜合錯義突變(c.375A>C，p.H36P)

Figure2Themissensemutations(c.375A>C，p.H36P)ofCTNNB1gene

圖3 HCC患者腫瘤及正常組織中β-catenin蛋白表達(×400)

Figure3β-cateninexpressionintumorandnormaltissuesofHCCcases(×400)

表1CTNNB1基因突變與臨床病理特征相關性

Table1TherelationshipbetweenclinicopathologicalcharactersandCTNNB1mutations

臨床參數CTNNB1突變有無P性別0.460 男382 女015發病年齡(歲)0.105 <50046 ≧50351HBV感染0.394 有378 無019分化程度0.647 高分化02 中分化375 低分化020

3 討論

大量研究顯示，包括HCC在內，不同類型的癌癥中均檢測到了CTNNB1基因突變，并且突變大多發生在3號外顯子區域。該基因突變能夠造成其編碼蛋白β-catenin表達異常，在胞質內聚集并轉位入核導致Wnt/β-catenin信號通路異常活化，并進一步影響到細胞的生存、增殖、分化及血管生成等各種功能。

目前已發現其異常表達與很多癌癥的發生有關，如肝癌、結腸癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌和前列腺癌等[5-8]。本研究在100例HCC患者腫瘤組織中發現了兩種雜合錯義突變，突變率為3%，其中1例突變 (c.363 A> T) 引起密碼子32所編碼的天冬氨酸變為了纈氨酸 ( p.D32V)；另外2例患者的同一種突變 (c.375 A> C)，則使密碼子36所編碼的組氨酸變為了脯氨酸 ( p.H36P)。這兩種突變均位于既往報道中的CTNNB1基因3號外顯子突變熱點區域(密碼子32、33、36、37、41、45等區域)[9-11]，即正好位于β-catenin蛋白的重點功能區域氨基端，這一區域包括糖原合成酶激酶3β (Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β) 和酪蛋白激酶1α (Casein kinase1α，CK1α) 的磷酸化位點，其中，密碼子33、37、41為GSK-3β的磷酸化位點、密碼子45為CK1α的磷酸化位點；而本研究檢測到的兩種突變分別位于密碼子32、36，則屬于鄰近GSK-3β綁定位點的非磷酸化位點，一些研究報道認為該類突變主要是通過氨基酸的結構變化引起蛋白質的功能改變，干擾β-catenin與GSK-3β等激酶的正常結合并致磷酸化異常，正常情況下， β-catenin 的磷酸化是啟動其泛素降解的起始信號，以上突變最終可能導致β-catenin 逃避降解，并在胞內水平升高[12-13]。因此，本研究進一步檢測這3例HCC患者腫瘤及配對正常組織中的β-catenin蛋白表達情況，結果均顯示β-catenin蛋白在正常組織中弱表達，在腫瘤組織中的表達則相對明顯增強，提示本研究所檢測到的2種突變很可能直接導致了患者腫瘤組織中β-catenin蛋白的異常高表達。在生理狀態下，Wnt/β-catenin信號通路參與調控正常肝細胞的功能，動物實驗發現，剛出生的小鼠體內β-catenin含量會迅速升高并在細胞核內聚集，這種變化與肝細胞的增殖活躍相一致，在短期內可促進肝臟的生長；在成年期的肝臟，該基因磷酸化失活，β-catenin蛋白大部分位于細胞膜上，很少出現于細胞質和細胞核中[14-15]。針對不同物種的研究又發現，小鼠、大鼠及人類肝臟再生時，β-catenin均有顯著的升高，這種升高是由于蛋白降解的減少所致，而非mRNA的高表達造成，因此，Wnt/β-catenin通路在肝臟的生長和再生修復中發揮著重要的作用[16]，但這種生理性的升高通常在48 h內降至正常水平。病理狀況下，胞漿內β-catenin水平升高入核形成β-catenin-Tcf/Lef復合體，通過調控其下游靶基因的表達并與其它信號通路，如核因子-κB(Human nuclear factor-kappa B,NF-κB)、轉化生長因子β (Transforming growth factor-β，TGF-β) 等通路相互作用而參與HCC的發生，轉移等過程[17-18]。

HBV慢性感染是我國HCC發生的最主要病原之一，既往針對CTNNB1基因突變與HBV相關HCC的研究結果并不一致，部分研究在HBV相關HCC患者中檢測到較高的CTNNB1基因突變率[20]，而較多的研究則認為相對于丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus，HCV) 感染或飲酒相關的HCC，CTNNB1的基因突變率在HBV相關HCC中是相對較低的[21-22]。本研究觀察到3例檢測出突變的患者共同的特征都是大于50歲的男性HBV感染患者，但經過統計分析，突變與臨床病理特征之間的關系無統計學意義，可能與納入研究的樣本量相對較小、同時在本研究人群中所發現的突變率較低有關，還需加大樣本量進一步證實，并考慮該基因其它外顯子突變的可能性。

4 結論

本研究結果表明，CTNNB1基因3號外顯子突變存在于HCC患者腫瘤組織中，并導致其編碼蛋白的異常表達，可能與HCC的發生相關。由于納入研究的樣本量較小，需擴大樣本量對該基因變異予以進一步驗證。