分子改造提高谷氨酰胺轉氨酶的催化活性

任蕊蕊,劉松*,李江華,堵國成,陳堅

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)2(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

谷氨酰胺轉氨酶(EC 2.3.2.13, Transglutaminase, TGase)，可以催化肽鏈中的谷氨酰胺殘基中的γ-羧酰胺基與酰基受體發生轉酰基反應，從而使蛋白質或多肽之間發生共價交聯[1]。TGase在食品加工領域的應用廣泛，比如，TGase可使蛋白質與必須氨基酸(如賴氨酸)交聯，提升缺少該必須氨基酸的肉制品等食品的營養價值[2]。TGase可以改善肉制品的特性，比如持水性、黏性、乳化穩定性，減少儲藏損失和烹飪損失[3]。此外，TGase在生物技術研究和醫藥[4-7]，紡織業[8]及皮革加工[9]等領域均有廣泛的應用。

由于催化活性不高，較高的應用成本導致TGase在工業應用上受到了一定的限制[10]。YOKOYAMA等[11]通過對其活性中心Cys64附近氨基酸進行隨機突變，在151種突變體中獲得了34個正向突變；對整個成熟區氨基酸進行隨機突變，在24 000個突變體中獲得了10個正向突變。隨機突變需要大規模的篩選，獲得正向酶突變體的時間較長。隨著生物信息學的發展，部分軟件已經可以通過蛋白質的結構計算氨基酸突變能(如Discovery Studio[12-13]等)，預測能影響酶蛋白與其底物復合物相互作用的關鍵氨基酸位點，進而對其突變，提高酶與底物的親和力。

本研究通過Discovery Studio 2017軟件分析，預測了能提高茂源鏈霉菌(Streptomycesmobaraense)TGase與其底物α-N-CBZ-GLN-GLY親和力的氨基酸位點，通過定點突變獲得了酶活和催化活性提高的突變體，為發酵法制備pro-TGase提供了潛在工業化生產菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株與質粒：表達質粒pINA1297、宿主解脂耶氏酵母Yarrowialipolyticapo1h來源于本實驗室前期構建保存[14]。pINA1297/TGase為作者實驗前期構建。

種子培養基(YPD，g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。

篩選培養基(酵母基礎氮源培養基，YNB，g/L)：YNB 6.7，葡萄糖20。

固體培養基則是在液體培養基中加2%的瓊脂。

發酵培養基(g/L)：甘油 15，酵母膏 20，氯化銨2.64，KH2PO40.32，無水MgSO40.25，VB13.34×10-4，調pH至8.0。

酶、試劑、引物和DNA序列測定：限制性核酸內切酶購自Thermo Fisher Scientific公司，膠回收試劑盒和Competent Cell Preparation Kit試劑盒購自Takara(大連)公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。引物合成和DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 軟件分析

利用Discovery Studio 2017軟件(BIOVIA，美國)的虛擬氨基酸突變模塊進行計算突變后的酶與wild type的結合自由能差值[ΔΔGmut=ΔGbind(mut)-ΔGbind(WT)]。利用在線服務器SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)，以S.mobaraenseTGase(PDB，1iu4，與本研究中TGase的氨基酸序列完全一致)為模板，利用構建了TGase及其突變體的模擬結構。利用PIC在線服務器分析TGase及其突變體分子內作用力的變化。

1.2.2 定點突變基因的克隆和重組質粒的構建

以StreptomycesmobaraenseTGase基因組DNA為模板，P1和P2，P3和P4，P1和P5(表1)為引物進行PCR，通過PCR擴增得到含有Y24W、E300W、Y302R的突變基因片段。PCR產物經DpnI消化后，分別進行膠回收。

表1 基因克隆及定點突變引物Table 1 Primers used for gene cloning and site-specific mutagenesis

以質粒pINA1297/TGase為模板，以上述回收產物為大引物，分別進行大引物PCR獲得定點突變的表達載體片段。PCR產物經DpnI消化后進行膠回收。回收產物轉入大腸桿菌JM109感受態中，菌落PCR后挑選1～2個轉化子交由上海生工生物工程有限公司進行測序。測序成功，則說明上述突變基因成功整合到質粒pINA1297(hp4d，ura3d4，XPR pre，XPR2t)上，質粒pINA297/Y24W、pINA297/E300W和pINA297/Y302R構建成功。

1.2.3 解脂耶氏酵母的轉化與重組子的篩選

將構建的重組質粒pINA1297/Y24W、pINA1297/E300W、pINA1297/Y302R，分別經快切酶NotI酶切后，膠回收得到相應的線性化質粒。然后用醋酸鋰轉化法轉化Y.lipolyticapo1h感受態[15]，質粒通過zata整合位點將突變基因整合到Y.lipolyticapo1h(Ura-，ΔAEP，ΔAXP，Suc+)基因組中。整合成功的Y.lipolyticapo1h會使其從尿嘧啶(ura)缺陷型菌株轉化為非缺陷型菌株。通過缺乏ura的YNB培養基28 ℃，培養3～6 d后，獲得重組菌Y.lipolyticapo1h/Y24W、Y.lipolyticapo1h/E300W、Y.lipolyticapolh/Y302R的陽性轉化子。

1.2.4 pro-TGase的表達

選取10～15個重組菌的陽性轉化子，接種于YPD液體培養基中，于28 ℃，200 r/min的搖床中培養24 h。將種子液以10%的接種量轉接于發酵培養基中，28 ℃，200 r/min搖瓶培養120 h。

1.2.5 pro-TGase的純化方法

采用強陽離子純化柱Fractogel EMD SO3-進行純化，具體參考劉松等[16]所述的方法。

1.2.6 濃度的測定

蛋白質濃度測定采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒，具體按說明書操作。

1.2.7 動力學常數的測定

在底物質量濃度為0～30 mg/mL范圍內設定濃度梯度，均按1.2.6中所述的方法測酶活，通過雙倒數作圖法計算可得動力學參數Km值。

1.2.8 半衰期檢測

將純化后TGase及其突變體稀釋到同一濃度，放置于55 ℃水浴保溫120 min，每15 min取1次樣測TGase酶殘余活力。蛋白的半衰期(t1/2)可通過作活力-時間的關系圖解得。

1.2.9 最適反應溫度的檢測

測定純化后的TGase在20～70 ℃(20、30、37、50、55、60、70 ℃)下的酶活，分析TGase及其突變體的最適反應溫度。

1.2.10 最適反應pH及pH穩定性的檢測

在37 ℃條件下，測定不同pH值底物條件下的酶活，分析TGase及其突變體的最適反應pH。將樣品用不同pH值的緩沖液值稀釋至pH3.0～10.0，37 ℃保溫1 h后測殘余酶活，分析TGase及其突變體在不同pH下的穩定性。

2 結果與分析

2.1 突變位點的確定

運用Discovery Studio 2017軟件的分子對接模塊，構建S.mobaraenseTGase[17]與其底物α-N-CBZ-GLN-GLY的復合物。再利用該軟件的虛擬氨基酸突變模塊，對TGase的所有氨基酸進行丙氨酸掃描，基于突變能變(ΔΔGmut)分析影響其與底物α-N-CBZ-GLN-GLY親和力的關鍵氨基酸[12]。一般認為，ΔΔGmut值是負值就表明突變后能量下降，結合更穩定，酶對底物親和力提高；反之就表明突變后能量上升，酶對底物親和力下降[12]。基于此，選取ΔΔGmut值最小的8個關鍵氨基酸分別進行虛擬氨基酸飽和突變，根據預測結果，選取ΔΔGmut降低的3個突變體(Y24W、E300W和Y302R)進行突變驗證(表2)。

表2 S. mobaraense TGase突變體突變能分析Table 2 Partial amino acids with reduced mutation energy in S. mobaraense TGase

2.2 TGase突變體在Y. lipolytica 中的表達與純化

前期研究發現，TGase前導肽對其正確折疊和分泌有重要影響[18]，在異源宿主中通常以酶原pro-TGase形式表達，通過體外添加活化蛋白酶切割其前導肽下得到成熟TGase[19]。本研究在Y.lipolytica中，以酶原形式表達分泌pro-TGase及其突變體，表達質粒結果如圖1所示。

圖1 TGase及其突變體質粒示意圖Fig.1 The plasmids map of TGase and its mutants注：[1]為TGase，Y24W，E300W或Y302R基因在質粒pINA1297中所處的位置

重組菌搖瓶發酵培養，取其發酵上清液，經dispase活化后測TGase酶活。經檢測重組菌Y24W、E300W、Y302R的最高酶活分別為0.916、16.99、0.635 U/mL，出發菌株pro-TGase的酶活為11.7 U/mL。結合SDS-PAGE圖，發現E300W較野生酶的酶活和表達量均有提高；Y24W和Y302R的酶活和表達量均大大降低(圖2)。

M-Marker;1-pro-TGase;2-Y24W;3-E300W;4-Y302R圖2 TGase及其突變體酶活(a)與對應重組菌的發酵上清SDS-PAGE分析圖(b)Fig.2 The enzyme activity of TGase and its mutants(a),and SDS-PAGE analysis of the corresponding fermentation supernatant(b)

通過強陽離子交換柱Fractogel EMD SO3-進行純化。SDS-PAGE分析顯示(圖3)，純化后的pro-TGase及突變體條帶出現了3條帶，且其實際分子質量大于理論分子質量(43 kDa)的條帶脫尾。通過CBS Net NGlyc 1.0 Server在線服務網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)預測了TGase基因中的N-糖基化位點(圖4)，發現N282和N297兩個位點是TGase的潛在糖基化位點。故出現上述結果的原因可能是酶表達后發生了不同程度的糖基化[14]。

M-Marker；1-pro-TGase；2-Y24W；3-E300W；4-Y302R；5-用糖苷酶Endo H酶處理過的pro-TGase；6-Endo H圖3 pro-TGase及其突變體純化后SDS-PAGE分析Fig.3 The SDS-PAGE analysis of pro-TGase and its mutants after purification

圖4 TGase中糖基化位點預測結果Fig.4 Potential glycosylation sites in TGase

2.3 突變對酶反應動力學的影響

將純化后的pro-TGase及其突變體用dispase處理，轉化為成熟TGase及對應的突變體，進行酶反應動力學分析。與野生酶相比，突變體E300W的比酶活提高了31%；Y24W和Y302R的比酶活分別下降63%和78%。突變體Y24W、E300W和Y302R的Km值分別上升了15%、10%和18%，說明突變會不同程度的影響酶與底物的親和力。突變體E300W的kcat值提高了42%；另外2種突變體均有下降。突變體E300W的kcat/Km值提高了29%，酶的催化效率提高；Y24W和Y302R的kcat/Km值分別降低了68%和81%，酶的催化效率降低。與野生酶相比，Y24W、E300W和Y302R在55 ℃下的半衰期t1/2均降低。

表3 TGase及其突變體酶學特性Table 3 Enzyme properties of TGase and its mutants

2.4 最適反應溫度的研究

對TGase及其突變體進行最適反應溫度的研究。研究發現，Y24W、E300W、Y302R及TGase在20～70 ℃的酶活變化情況基本一致，最適反應溫度都是55 ℃(圖5)。低于55 ℃時，隨溫度升高，TGase酶活緩慢上升；高于55 ℃時，隨溫度升高，TGase酶活下降。反應溫度在50～60 ℃范圍內酶的催化效率均是最高酶活的75%以上；反應溫度為70 ℃時，酶的催化效率仍是最高酶活的20%以上。

圖5 TGase及其突變體的最適反應溫度Fig.5 The optimum temperature of TGase and its mutants

2.5 最適反應pH和pH穩定性的研究

對TGase及其突變體進行最適反應pH的研究。結果顯示(圖6-a)，TGase及其突變體的最適反應pH均為7.0。低于最適反應pH時，TGase活性隨pH增加而緩慢增加；高于最適反應pH時，TGase活性隨pH增加而緩慢下降。突變體Y302R在pH 3.0～10.0范圍內相對殘余酶活均在48%以上。

對TGase及其突變體進行pH穩定性的研究。結果顯示(圖6-b)，Y24W、E300W、Y302R及TGase的pH穩定范圍均為5.0～9.0。TGase及其突變體在pH 6.0～8.0范圍內的相對殘余酶活均大于75%，在pH 5.0～9.0范圍內的相對殘余酶活均大于50%。pH低于5.0或高于9.0后，酶活急劇下降。

圖6 TGase及其突變體最適反應pH(a)和pH穩定性(b)Fig.6 The optimum pH (a) and the pH stability (b) of TGase and its mutants

2.6 催化效率和穩定性機制分析

研究表明，蛋白質分子內作用力的種類和數量對酶分子的催化效率和熱穩定性有重要影響[20]。為解析E300W催化效率提高的機制，TGase分子的催化活性基團Cys64、Asp255和His274均位于分子裂縫的底部[17](圖7)。TAGAMI等[21]通過分子對接實驗模擬了TGase與底物CBZ-Gln-Gly的結合方式，顯示CBZ-Gln-Gly在分子裂縫中被拉伸，活性位點通過疏水相互作用與底物結合。YOKOYAMA等[11]研究顯示分子正面(Tyr75Phe，Gln74Ala，Thr77Phe等)及背面(Arg26Phe，Ser299Leu，Ser303Phe等)的疏水性氨基酸取代突變可提高TGase催化活性。與上述報道一致，在本研究中，TGase第300位氨基酸殘基位于分子背面且與裂縫區域臨近，且由野生酶的Glu突變為疏水性更強的Trp，酶的催化活性提高。然而，E300W底物親和力較野生酶有輕微下降，而酶轉換數顯著提高。基于突變位點的位置特點，E300W中的親核攻擊能力可能得到了加強，進而提高了酶的催化活性[21]。

為解析TGase突變體穩定性變化的機制，利用PIC在線服務器分析了TGase及其突變體分子內作用力的變化(表5)。結果顯示，與TGase相比，Y24W、E300W和Y302R的主鏈-主鏈氫鍵分別減少1、2、4個；Y24W、E300W和Y302R分子在的氫鍵分別增加3、0和1個。因此，主鏈-主鏈氫鍵的減少可能是造成TGase及其突變體穩定性下降的重要原因。

表4 TGase及其突變體分子內相互作用力分析Table 4 Interactions potentially involved in the stability of TGase and its mutants

圖7 TGase(a)及E300W(b)三維結構圖Fig.7 The model structure of TGase (a) and E300W (b)(注：藍紫色部分表示催化三聯體，黃色部分表示TGase和E300W的第300位氨基酸。)

3 結論

本研究利用Discovery Studio2017軟件，通過對TGase及其配體復合物進行基于相互作用力的虛擬氨基酸突變，預測了能提高親和力的氨基酸突變目標Y24W、E300W、Y302R。實驗證明突變體E300W酶活、比酶活和催化活性分別比野生TGase提高45%、31%和29%；Y24W、Y302R的酶活、比酶活和催化活性降低。上述結果表明，TGase第24、300、302位氨基酸是影響TGase結構的關鍵氨基酸。值得注意的是，上述突變導致酶穩定性在不同程度下降。下一步研究中，可以對上述3個位點進飽和突變及組合突變，以期獲得高催化活性和高穩定性的TGase。此外，E300W到在重組Y.lipolyticapo1h中的產量達到16.99 U/mL，較野生酶(11.7 U/mL)表達水平明顯提高，可作為替在工業生產菌株。