外源添加維生素C對鏈霉菌ε-聚賴氨酸發酵的影響

孫浩本，顏鵬，陸鵬麒，毛忠貴，唐蕾,*

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122) 2(江南學大 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是微生物合成的短肽，由25～35個賴氨酸殘基經α-COOH和ε-NH2縮合而成[1]。作為天然產物，ε-PL具有良好的生物相容性，無毒且具有廣譜抑菌作用，可應用于食品、醫藥等領域，市場前景廣闊[2]。目前鏈霉菌發酵是ε-PL工業化生產的主要方式，由于產物濃度低、成本居高不下,對原始菌株進行遺傳改造，獲得ε-PL高產菌株成為解決問題的首選方式。HAMANO等[3]研究發現，天門冬氨酸激酶是L-賴氨酸代謝途徑的關鍵酶，HIRAKI等[2]通過解除/降低L-賴氨酸對天門冬氨酸激酶的反饋抑制，在早期的ε-PL生產菌改造中非常奏效，產量從原始菌株的0.2 g/L提升至2.1 g/L。但是這種通過對單一酶進行改造的方法具有明顯的局限性。LI等[4]采用基因組重排技術(genome shuffling, GS)同時提高了StreptomycesgraminearusLS-B1對葡萄糖耐受性和ε-PL的產量；李雙等[5]從已有不同表型的ε-PL菌株出發，再進行GS，使得ε-PL產量在原有基礎上有了進一步提升；吳光耀等[6]采用核糖體工程菌株育種的手段，通過鏈霉素(Streptomycin, Str)和利福平素(Rifampin, Rif)2種抗生素抗性篩選，獲得了1株ε-PL高產突變株StreptomycesalbulusWG-608，其搖瓶產量達到3.7 g/L，較出發菌提高了42.3%。

建立在優良菌株基礎上的發酵工藝優化是提高ε-PL產量的另一種有效策略。KAHAR等[7]根據Streptomycesalbulus410在菌體生長和ε-PL合成過程中的pH關系，建立了兩階段pH值調控策略，在5 L攪拌式發酵罐中補料-分批發酵，ε-PL產量從5.7 g/L提高到48.3 g/L。REN等[8]基于酸性pH值對菌體代謝活力的影響以及沖擊相關參數的優化，建立了一種酸性pH值沖擊策略，經過192 h的補料-分批發酵，ε-PL的最高產量達到54.7 g/L，與未經過pH值沖擊的發酵相比提高了52.5%。

添加不同的外源物質也是一種有效的手段。CHEN等[9]從補料-分批發酵的72 h開始不斷脈沖流加1 g/L的L-賴氨酸直到發酵結束，最終的ε-PL產量達到37.6 g/L，比對照提高了6.2%。LIU等[10]在補料-分批發酵過程中通過流加酵母粉的方式提高菌體活力、促進菌體生長，最終的ε-PL產量為28.2 g/L，與對照相比提高了73%。

本研究的前期工作通過對GS菌株和親本菌株的比較，發現GS菌株具有較好的pH值和ε-PL耐受性及抗氧化脅迫能力，發酵后期細胞活性和ε-PL均保持較高水平。因此設想是否可以通過添加外源物質，提高鏈霉菌ε-PL發酵過程中的抗氧化脅迫能力，從而達到產量提升的目的，為ε-PL的發酵控制提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

GS菌株Streptomycessp. AF3-44為作者實驗室前期研究中經過3輪GS篩選得到的ε-PL耐受型菌株[5]。

1.1.2 培養基

固體培養基(BTN)、種子培養基參考文獻[5]。發酵培養基(g/L)：葡萄糖 60.0，酵母粉 8.0，(NH4)2SO45.0，K2HPO4·3H2O 2.0，MgSO4·7H2O 1.0，ZnSO40.04，FeSO4·7H2O 0.03。1×105Pa滅菌20 min，用體積分數為50%的氨水調pH值至6.9。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

固體培養、種子培養參照文獻[5]。

搖瓶發酵：將濃度為2 mol/L的Vc母液，經0.45 μm的濾膜除菌后，分別在相應的發酵階段添加1 mL(對照組添加等體積無菌水)，為了避免添加后因pH值的下降對發酵帶來影響，用2 mol/L NaOH調節pH值至發酵階段pH值。

分批發酵：在5 L發酵罐中，以裝液總體積為3.5 L進行分批發酵，其中發酵培養基為3.26 L，種子液為0.24 L。發酵培養溫度為30 ℃，初始轉速為200 r/min，通氣量維持在1 vvm，接種前校正溶氧為100%，發酵時間延長菌體量增多，好氧需求變大，溶氧迅速降低，待溶氧降至20%時采用溶氧關聯轉速的方式來自動控制溶氧水平，通過增加轉速來維持溶氧20%，每隔一定時間進行取樣，分別對葡萄糖、菌體干重(dry cell weight，DCW)、ε-PL濃度進行測定，直至葡萄糖耗盡后，發酵結束。添加Vc的分批發酵罐中預裝已滅菌的發酵培養基3.06 L，種子液0.24 L，0.875 mol/L的Vc 0.2 L，總體積維持在3.5 L。在5 L罐上以不添加Vc作為對照組，pH值降到4.0時，通過流加體積分數為50%的氨水維持pH值4.0至發酵結束。添加Vc的實驗組在pH值自然下降到4.0時，通過流加體積分數為50%的氨水維持pH值恒定的同時，將膜過濾的Vc溶液經蠕動泵緩慢流加，流加速率以溶氧維持20%進行適當調節。

1.2.2 發酵過程參數的測定

ε-PL濃度的測定參考ITZHAKI等[11]的方法。DCW的測定參考CHEN等[12]的方法。

1.2.3 丙二醛(malonaldehyde，MDA)和ROS的測定

參考曾昕等[13]的方法。

1.2.4 細胞活力的測定

參考周永鵬等[14]的方法。

1.2.5 細胞提取液的制備

參考顏鵬等[15]的方法。

1.2.6 細胞膜脂肪酸含量的測定

參考任喜東[16]的方法。

1.2.7 抗氧化酶類活力測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)參考史競艷等[17-18]的方法。過氧化氫酶(catalase，CAT)參考燕國梁[19]的方法。

1.2.8 總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)的測定

采用總抗氧化能力(T-AOC)測試盒(奧青生物科技有限公司，南京)，按照說明書的要求進行操作。

1.2.9 顯著性分析

采用SPSS Statistics 19(IBM，USA)進行方差分析(Fisher’s least significant difference，LSD)，當p值<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Streptomyces sp. AF3-44菌株發酵過程中菌體活力和ROS水平的變化

前期研究表明AF3-44菌株胞外ROS的水平隨著發酵進行呈上升趨勢，本研究采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)熒光染色的辦法，進一步分析胞內ROS的變化。DCFH-DA沒有熒光，進入細胞后被酶水解為DCFH(dichlorofuorescin)。在ROS存在下，將DCFH氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質DCF(dichlorofluorescein)，細胞內活性氧水平與熒光強度成正比。

細胞活力常常以細胞有氧呼吸的能力來表征。作為一種細胞氧化還原代謝的指示劑，5-氰基-2, 3-二-(p-芐基-四唑氯化物)(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride, CTC)可進入細胞，并被呼吸鏈中的還原酶還原，得到顯紅色熒光的產物[20]。

如圖1-A所示，ROS染色顯示綠色熒光強度逐漸增強，尤其是在54 h之后尤為明顯，說明胞內的ROS逐漸累積增多，ROS不斷積累會造成細胞的氧化損傷，包括蛋白質、脂質和DNA的氧化[21]，從而導致菌體活力降低；同時，CTC染色顯示紅色熒光強度減弱，表明菌體活力有所下降(圖1-B)。以上結果與搖瓶發酵過程參數變化相一致(圖2)，即在低pH值和ε-PL快速合成和積累的發酵后期，菌體受到的氧化脅迫增強，活力降低，因此通過外源添加抗氧化物質有可能減少傷害的發生，提高菌體活力和ε-PL的發酵水平。

圖1 細胞內ROS(A)和細胞活力(B)染色Fig.1 Cell intracellular ROS (A) staining and viability (B) staining注：圖A上半部分與圖B上半部分為熒光下拍攝的影像；圖A下半部分和圖B下半部分是明場下拍攝的影像。

圖2 搖瓶發酵過程參數Fig.2 Profile of process parameters in shake-flask fermentation

2.2 Vc對菌體生長和ε-PL合成的影響

Vc可以清除微生物體內多余的氧自由基，防止細胞受到氧化損傷[19]。XIAO等[22]在甲醇補料階段加入Vc可明顯緩解細胞內ROS對細胞膜的損傷，發酵結束時細胞活力增強，水蛭素產量達到5.0 g/L比對照高出7%。在青霉菌的類胡蘿卜素生產中，Vc的添加替代了β-胡蘿卜素的抗氧化作用[23-24]。REN等[25]在利用裂殖壺菌產DHA的發酵過程中采用兩點法添加Vc策略，使得DHA的產量提高30%。另外Vc價格低，食用安全，不會對后續的ε-PL純化帶來安全風險。

因此，選取Vc作為抗氧化劑，考察Vc的添加時間和添加濃度對ε-PL搖瓶發酵的影響。結果如表1所示。Vc的添加時間和添加濃度對ε-PL發酵和菌體量均有影響，其中在24 h添加Vc(濃度為50 mmol/L)時產量達到2.45±0.04 g/L，比對照高出18.93%(p<0.05)，而菌體量為5.84±0.06 g/L與對照的5.93 g/L相差不大。表明隨著Vc的添加，ε-PL的生產得到較大的增強，尤其是單位菌體的合成能力。Vc添加的最佳條件下單位菌體的合成能力達到了0.42 g ε-PL/g菌體，高于對照的0.35 g ε-PL/g菌體。因此選擇發酵至24 h添加Vc溶液(50 mmol/L)進行后續實驗。

表1 Vc添加時間和濃度對細胞量和ε-PL濃度的影響Table 1 The addition time and concentration of Vc on biomass and ε-PL titer

2.3 Vc對菌體抗氧化脅迫能力的影響

細菌中的ROS水平與抗氧化系統有密切的關聯，通常細菌體內ROS水平激增都伴隨著體內抗氧化系統活力的減弱。還原性酶活力降低和還原性物質不足均會導致細菌中ROS的大量產生并在體內不斷積累[26]。

微生物細胞內的抗氧化酶保護細胞免受ROS的損傷[27]。通過對抗氧化酶的測定，結果表明：對照組過氧化氫酶的活力基本維持在恒定水平且有升高的趨勢，而實驗組在24 h時，CAT活力高于對照，發酵后期CAT活力均處于較高水平，可以更好的抵抗氧化脅迫。這也與文獻報道相一致[28]。而對于SOD，對照組和實驗組總的趨勢是前期SOD酶活力高到后期降低，實驗組SOD初期高于對照組，而后期低于對照，且變化不明顯，一般認為SOD與CAT在微生物體內協同作用：SOD以O2-·作為底物，通過歧化反應SOD使O2-·歧化為H2O2和O2，從而起到清除O2-·的作用；產生的H2O2則在CAT作用下被清除，分解生成H2O和O2，而H2O2量的增加會抑制SOD酶的活性[29]，這與本文實驗結果也具有一致性(圖3-A，圖3-B)。

圖3 Vc對關鍵酶活力和總抗氧化能力的影響Fig.3 The effect of Vc on the key enzymes activities and total antioxidant capacity

生物體的抗氧化防御體系主要分為2大類。一類叫預防性抗氧化劑，主要包括SOD、CAT等。另一類叫自由基捕捉劑，包括VC、VE等[30]。因此除了考察細胞抗氧化酶的活力，還進一步測定細胞的總抗氧化能力，如圖3-C所示，Vc的添加改善了整個發酵過程中總抗氧化能力，總抗氧化能力較對照組均提高1.5倍以上，尤其在30 h總抗氧化能力達到最大，為8.91 U/(mg protein)。外源添加Vc顯著提高了菌體的抗氧化能力。近年來，已經有許多嘗試通過外部補充抗氧化劑，來改善細胞生長或目的產物的生產。LIU等[31]通過外加芝麻酚，提高總抗氧化能力，增加了Crypthecodiniumcohnii的細胞增殖和脂肪酸生產能力。這與本文的研究思路一致，且實驗結果具有一致性。

2.4 Vc對細胞膜氧化損傷的影響

大多數有氧代謝的微生物在細胞呼吸過程中都會產生ROS，其中高氧化活力的HO·將對生物大分子進行攻擊，從而破壞它們的結構，特別是細胞膜及其相關組分，為此本文考察了Vc的添加對細胞膜成分以及膜氧化損傷標志物MDA的影響。

Vc是食品工業中眾所周知的抗氧化劑，可以增強T-AOC并減少細胞中的ROS產生。高T-AOC對于許多必需的生物學功能是必不可少的，特別是必需的多不飽和脂肪酸過氧化，以及DNA損傷的保護[32]。實驗結果表明，Streptomycessp. AF3-44的細胞膜組成主要由飽和脂肪酸肉豆蔻酸(C14∶0)十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)以及不飽和脂肪酸肉豆蔻油酸(C14∶1)和油酸(C18∶1)組成。隨著時間的延長，環境pH值的下降，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸在細胞膜中的組成比例呈現出相反的趨勢：飽和脂肪酸在細胞膜中的含量下降；而不飽和脂肪酸的含量增加(圖4)。這在對照組和實驗組中具有一致性。值得注意的是同一時間點，實驗組不飽和脂肪酸所占的比例高于對照組。發酵結束時，實驗組總不飽和脂肪酸所占比例達到23.8%，高于對照19.4%。其中增加最明顯的為不飽和脂肪酸肉豆蔻油酸(C14∶1)，實驗組所占比例從8.5%提高到11.7%。細胞膜脂肪酸不飽和度的升高增強了膜的流動性，從而更加有利于細胞膜中物質的運輸以及能量代謝的發揮，以保證細胞在氧化脅迫條件下的生存與功能行使。這也與文獻報道相一致[16]。

圖4 細胞膜脂肪酸組成隨發酵時間的變化Fig.4 Changes of cell membrane fatty acid composition with the fermentation time

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，MDA水平的高低間接反映了膜系統受損程度。

如圖5所示，對照組MDA水平前期較低，后期較高。實驗組加入Vc后MDA水平顯著低于對照組，雖然在48 h之前實驗組和對照組相差并不大，這是由于在這一時間段菌體仍處于快速生長時期，抵抗氧化脅迫的能力較強；但是48 h之后菌體生長能力下降，氧化脅迫作用逐步增強，此時Vc對脂質的保護效果更為突出，在60 h實驗組MDA含量為3.81±0.13 nmol/mg protein，相比于對照4.67±0.11 nmol/mg proteinMDA水平下降了18.41%。72 h時與實驗組MDA含量相比對照組下降幅度進一步增大，達到了29.30%。說明添加Vc后發酵后期，細胞膜脂質過氧化水平較低，氧化損傷較輕。這也與總抗氧化能力和CAT的變化趨勢相一致，因此Vc的添加緩解了細胞的氧化損傷。

圖5 細胞膜MDA含量隨發酵時間的變化Fig.5 Changes of cell membrane MDA content with the fermentation time

2.5 添加Vc對5 L罐分批發酵的影響

A-對照組；B-添加Vc實驗組圖6 5 L罐分批發酵過程參數Fig.6 Profile of fermentative parameters in 5 L fermenter

為了進一步比較添加Vc對ε-PL發酵性能的影響，在5 L罐上以不添加Vc作為對照組，pH值大約在14 h降到4.0時(此時ε-PL大量合成)，通過流加體積分數為50%的氨水維持pH值4.0至發酵結束。對照組發酵43.6 h結束，ε-PL產量為5.14 g/L，菌體量為18.54 g/L。實驗組在pH值自然下降到4.0時，通過流加體積分數為50%氨水維持pH值恒定的同時，將膜過濾的Vc溶液經蠕動泵緩慢流加，流加速率以溶氧維持20%進行適當調節，流加Vc整個過程大約2.5 h結束，最終44 h發酵結束，ε-PL濃度為7.73 g/L，菌體量為18.5 g/L。因此Vc的添加促進了ε-PL產量的提高。

3 結論與討論

ε-PL作為天然防腐劑應用潛力巨大，但是野生菌ε-PL的合成能力較低，近年來新型的育種方法如GS、核糖體育種等，較傳統的方法很大程度上提升了ε-PL的濃度[26-27]。補充外源添加物是發酵優化的一種常用手段，在ε-PL發酵中，多以添加氨基酸類[9,33]、營養基質[10]、吸附載體[34]為主。本文通過外源添加價廉與安全的抗氧化劑Vc，從生理角度進行初步的分析：發酵過程中隨著時間的延長，菌體活力逐漸下降，ROS水平逐漸積累升高；實驗結果表明搖瓶發酵中Vc最優的條件為：24 h添加濃度為50 mmol/L，此時ε-PL產量2.45±0.04 g/L，比對照高出18.93%；Vc的添加改善了整個發酵過程中總抗氧化能力、提高了細胞膜脂肪酸不飽和度、緩解了細胞的氧化損傷。而細胞膜脂肪酸不飽和度的升高增強了膜的流動性，從而有利于細胞膜中物質的運輸以及能量代謝的發揮，保證細胞在氧化脅迫條件下的生存與功能行使；細胞膜脂質過氧化水平降低，氧化損傷較輕。5 L罐分批發酵對照43.6 h發酵結束，ε-PL 5.14 g/L，菌體量18.54 g/L。實驗組44 h發酵結束，ε-PL 7.73 g/L，菌體量18.5 g/L，Vc的添加促進了ε-PL產量的提高。與此類似，GAFFNEY等[35]通過補充亞麻籽油提高了Schizochytriumsp.的T-AOC，改善不飽和脂肪酸的生產。而BURG等[36]發現添加鹽對培養基可以增強紫菜的T-AOC。這些結果表明通過調整氧化損傷和T-AOC狀態來改變細胞活力和產物合成是行之有效的手段。另外，外源添加Vc如何與現有的優良的發酵工藝相結合，進一步提高ε-PL產量還有待進一步的研究。