不同發酵劑對發酵羊肉香腸有害生物胺控制及游離脂肪酸釋放的影響

王德寶，王曉冬，康連和，梁俊芳，納欽，王莉梅，張園園

(內蒙古農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特,010031)

發酵香腸是指將絞碎的瘦肉與丁狀脂肪及輔料混勻后灌入腸衣，經自然或添加外源發酵劑發酵、干燥成熟制成pH值低于安全酸度5.3一類發酵肉制品[1-2]。低pH值使香腸成品色澤呈現玫瑰紅色，風味獨特，貨架期也相對延長[3-4]。pH值、風味物質、生物胺、游離脂肪酸等變化離不開糖類、蛋白質、脂肪等物質的氧化分解。pH值的變化主要是由乳酸菌對糖類物質分解產生乳酸等小分子有機酸所致，低pH值可抑制香腸中腐敗菌和致病菌的生長，也有助促進香腸水分活度(Aw)降低和亞硝酸鹽等酶類活性[5-6]。香腸干燥成熟過程為游離脂肪酸釋放的關鍵時期，降低飽和脂肪酸、增加不飽和脂肪酸含量是提高香腸品質關鍵，且游離脂肪酸又進一步被氧化分解為醇、醛、酮等，是香腸風味物質的主要來源[7-8]。香腸發酵成熟過程中，蛋白質主要被分解為多肽、寡肽以及游離氨基酸，這些小分子物質被稱為非蛋白氮，也為香腸風味貢獻一定力量；且游離氨基酸在脫羧酶作用下被分解生成生物胺，少量胺類物質有助于機體正常生長發育，若在體內積累過量則會造成毒害作用，并且易與亞硝酸結合成具有強致癌的亞硝胺，因此食品中生物胺也成為近年來重點關注的食品安全問題。因而選擇具有降生物胺特性的微生物作為香腸發酵劑，是目前發酵肉制品研究重點方向。本試驗選擇具有降生物胺特性的清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌作為羊肉香腸發酵劑，探究其對發酵羊肉香腸中有害生物胺含量控制及游離脂肪酸釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要原輔料

原料肉：羊肉(肥瘦比為1∶4)，購于內蒙古呼和浩特市北亞清真食品市場。腸衣：25～30 mm羊小腸。輔料：食鹽、抗壞血酸鈉。發酵劑：清酒乳桿菌(Lactobacillussake)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)，由內蒙古農業大學食品科學與工程學院微生物保藏實驗室提供。

主要藥品：蔗糖、葡萄糖、抗壞血酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉：分析純，上海國藥集團有限公司；單磺酰氯、組胺、β-苯乙胺、精胺、酪胺、亞精胺、尸胺、1,7-二氨基庚烷、37種游離脂肪酸標準品：色譜級，美國Sigma公司；甲醇、正己烷及丙酮：色譜級，上海安譜實驗科技股份有限公司。

主要儀器：F-11 pH計，香港興萬電子儀器有限公司；HD-3A智能水分活度測量儀，上海精密儀器儀表公司；LRH-250-HS恒溫恒濕培養箱，天津市福元銘儀器設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；GC2014島津氣相色譜儀，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 香腸工藝[2]

配方：羊后腿肉80%、羊尾肥膘20%、蔗糖0.5%、食鹽2.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、硝酸鈉100 mg/kg、葡萄糖0.5%、抗壞血酸鈉0.05%、發酵劑107CFU/g。

1.2.2 試驗設計

在采用預試驗、菌株降生物胺特性以及單因素模擬試驗基礎上，獲得發酵劑清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌最佳復配比為1∶2。本試驗共分3組，第1組為對照組(不加外源發酵劑)，第2組為單一清酒乳桿菌(Lactobacillussake)組，第3組為清酒乳桿菌(Lactobacillussake)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)復配組(1∶2)。分別于灌腸后(4 ℃)、腌制(4 ℃)、發酵結束(25 ℃)、干燥中期(15 ℃)、干燥結束即成熟(13 ℃)、后熟14 d(4 ℃)、28 d(4 ℃)等工藝點測定香腸理化指標。

1.2.3 理化指標測定

1.2.3.1 pH值、Aw、亞硝酸鹽殘留量的測定[9-10]

參照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》、GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定香腸pH值、亞硝酸鹽；使用HD-3A型智能水分活度儀測定Aw。

1.2.3.2 蛋白質分解指數(PI)測定[11-12]

針對海上風電嵌巖區域的風機基礎比選，首先應確定樁型。根據目前國內樁基設計、樁型工程應用、施工水平和施工經驗，適宜于海上或潮間帶風電場的樁基主要有鋼管樁、高強預應力混凝土管樁(PHC樁)和鉆(沖)孔灌注樁三類。

參考DIAZ和HUGHES描述的方法，將2 g肉樣加到含有18 mL蒸餾水的50 mL離心管中，用組織破碎機均質2 min，然后在5 ℃條件下100 r/min離心15 min，用whatman1# 過濾上清液，重復1次，稱量濾液體積 (V)。取15 mL濾液和15 mL 10%TCA混合，在室溫下靜置30 min，與上述同樣條件下離心，用whatman4# 過濾上清液，取5 mL用凱氏定氮的方法測定氮含量N1，通過N0(0.2V×N1)計算非蛋白氮含量，總氮含量為N。蛋白水解指數PI=N0/N。

1.2.3.3 生物胺測定

參照GB/T5009.208—2008測定發酵香腸中生物胺含量[13]。

色譜條件：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流速0.8 mL/min，紫外檢測波長254 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，流動相A為甲醇，B為超純水。

1.2.3.4 脂肪酸測定

脂肪酸提取：稱取低溫下粉碎樣品10 g于250 mL三角瓶，加入135 mL Folch液(三氯甲烷∶色普級甲醇=2∶1)，振搖3 h后浸泡8 h用G3漏斗過濾，移取5 mL、質量濃度200 g/L NaCl溶液于濾液中。待靜置分層吸取下層，在下層液體中加入適量無水Na2SO4脫水。一段時間后將液體吸入旋轉蒸發瓶，40 ℃水浴條件下濃縮即得脂肪。加入0.5 mol/L NaOH/ CH3OH溶液5 mL，70 ℃下回流5 min。加入5 mL三氟化硼-乙醚和甲醇混合液(1∶3)，70 ℃下回流2 min，進行甲酯化。再加3 mL正己烷，70 ℃下回流1 min。接著加入5 mL飽和NaCl溶液，靜置10 min，移取1 mL上層液體于1.5 mL離心管中，放入-80 ℃冰箱中待測。

氣相色譜條件：升溫程序：初溫為120 ℃，保持5 min，然后以4 ℃/min的速率升至250 ℃，250 ℃保持28 min；進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃；載氣為高純氮氣(99.99%)，氫氣流速為40 mL/min，恒定柱流速為1.1 mL/min，分流比20∶1；進樣量1.0 μL。

1.3 數據處理

采用Excel和Spss19.0對數據進行統計處理和顯著性分析，p<0.05表示差異顯著，同組不同制作時間差異性用小寫字母表示，同一時間不同組間差異用大寫字母表示，相同字母表示不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同發酵劑對羊肉香腸pH值影響

發酵香腸pH值下降主要源于原料肉中微生物與發酵劑分解糖類生成乳酸等有機酸所致，促使香腸pH值迅速降至發酵要求5.3以下；隨著蛋白質被組織蛋白酶及發酵劑分解產生氨類等堿性物質的增加，由于酸堿中和，促使pH值逐漸回升[14-15]。

如圖1，發酵香腸在0～0.5 d腌制期，由于環境溫度(4 ℃)較低致使原料肉中微生物生命活動被抑制，pH值變化甚微；灌腸后香腸在25 ℃、90%～95% RH條件下發酵，發酵過程中3組pH值快速下降；發酵結束時(3 d)，對照組pH值(5.25)>單一組(5.02)>復配組(4.85)(p<0.05)，由此可知添加復配發酵劑產酸速率>單一發酵劑>對照組；3～6 d干燥過程環境溫度和濕度(RH)急劇下降到15 ℃、85%，隨著產酸速率下降及蛋白可能被分解所產生的堿性物質含量增加[16]，促使pH值呈現回升趨勢；6～9 d成熟過程降低的溫度和濕度，致使大部分微生物生命活動被抑制，酶活性也受到影響，因而氨類物質產生速率下降，pH值上升速率也變緩，發酵結束時3組pH分別為5.73、5.66、5.60；成品在4 ℃、貯藏2周情況下，與成熟期結束時pH值差異不顯著(p<0.05)。

圖1 不同發酵劑對發酵香腸pH值變化規律的影響Fig.1 Effects of different starter cultures on the pH change of fermented sausages

2.2 不同發酵劑對羊肉香腸A w影響

水分活度(Aw)已經成為衡量食品保藏期長短的一個重要指標，當Aw小于某個臨界值時，特定微生物生長活性將被抑制，如絕大多數細菌要求Aw大于0.9、霉菌要求Aw大于0.8，而耐鹽菌要求最低Aw為0.75，當Aw低于0.6時絕大多數微生物無法生長；并當食品中Aw<0.85時，酶活性大幅下降[17-18]。

圖2 不同發酵劑對發酵香腸Aw變化規律的影響Fig.2 Effects of different starter cultures on the Aw change of fermented sausages

由圖2可知，0～3 d 3組香腸Aw變化微小，均在0.98±0.01范圍內；3～6 d干燥期，因香腸內外RH差，促使水分逐漸向外部環境擴散，干燥初期結束時對照組、單一組、復配組Aw分別降低到0.91、0.90、0.90，下降幅度復配組>單一組>對照組，說明添加混合發酵劑可能較單一發酵劑和自然發酵更有助于Aw下降，此結論與吳滿剛等研究相似[19]；6～9 d成熟過程3組香腸Aw相比干燥過程下降幅度小，可能由于香腸肉餡外層水分擴散速率快于內層，導致外層較為干燥，限制了肉餡中心水分散發速率；在9～37 d，Aw下降緩慢，37 d末對照組和單一組均在0.83±0.01、復配組降到組中最低0.82。

2.3 不同發酵劑對羊肉香腸中亞硝酸鹽影響

亞硝酸鹽具有發色、抗氧化及防腐作用，可消除原料肉不適風味，提高產品質量[20]。但其殘留過量會與香腸中仲胺、生物胺生成具有強致癌作用的亞硝胺，是目前食品界備受關注的食品安全問題[21]。

圖3 不同發酵劑對低酸發酵香腸亞硝酸鹽變化的影響Fig.3 Effects of different starter culture on nitrite changes of low acid fermented sausages

由圖3可知，腌制初期硝酸鹽添加可能成為后期各組亞硝酸鹽含量增加主要源頭；發酵結束，對照組、單一組及復配組亞硝酸鹽含量(36.80、40.20、42.50 mg/kg)均有所增加，相比腌制結束，復配組亞硝酸鹽增加速率顯著快于單一組(p<0.05)，與含量最低對照組差異顯著(p<0.05)，這一現象可能是由于復合發酵劑產生硝酸鹽還原酶含量高于其他2組，加速硝酸鹽被還原；干燥期間環境溫度、RH、Aw下降，硝酸鹽還原酶活性可能被抑制或發酵劑對亞硝酸鹽分解速率加快，促使亞硝酸鹽含量急劇下降[22]；6～9 d變化不顯著；在9～37 d復配組亞硝酸鹽含量急劇降低，37 d末降到組中最低11.30 mg/kg，低于國家安全規定30 mg/kg[23]。

2.4 不同發酵劑對羊肉香腸PI影響

蛋白質分解指數(PI)在香腸制作過程中呈逐漸上升趨勢，曲線變化軌跡表明蛋白質在干燥成熟過程降解程度較高。原料肉PI為26.74%，腌制期間僅復配組PI上升；發酵結束，對照組、單一組、復配組PI為27.80%、28.13%、28.37%；干燥過程各組pH值上升促使蛋白分解酶活性逐漸增強，6 d末復配組PI上升至30.67%，顯著高于其他2組(p<0.05)；9 d末復配組、單一組PI為31.00%、29.83%，而對照組也上升至29.00%，說明蛋白質分解主要依賴內源酶；9～23 d的成品貯藏2周過程中非蛋白氮成分含量近下降2%左右，但在23～37 d貯藏過程中各組PI快速升高，37 d末PI與發酵結束時趨于相近。

圖4 不同發酵劑對發酵香腸蛋白質分解指數(PI)的影響Fig.4 Effects of different starter culture on protein discomposition index of fermented sausages

2.6 不同發酵劑對羊肉香腸中生物胺變化影響

本試驗采用新鮮無污染原料肉進行發酵香腸制作試驗，目的是降低原料肉衛生質量對生物胺積累的影響，并添加降生物胺發酵劑旨在減少有害生物胺在發酵香腸中檢出率。精胺和亞精胺在整個過程含量變化微小，且無毒害作用，因此本試驗僅測出3種有害生物胺—腐胺、酪胺及組胺。由表1所列3種生物胺變化規律可知，3組香腸中腐胺和酪胺在發酵、成熟(0.5～9 d)過程中含量增加較為顯著，9～37 d貯藏過程中含量則呈下降趨勢；通過組間比較可知，復配組腐胺含量增加速率緩慢，9～37 d酪胺含量下降速率顯著快于其他2組(p<0.05)；且酪胺僅在干燥成熟過程中檢出，復配組含量顯著低于對照和單一組(p<0.05)。綜觀3組香腸中3種胺總量變化，可知對照組和單一組顯著高于復配組(p<0.05)，說明添加復合發酵劑可有效降低有害生物胺在發酵香腸中的積累。

表1 不同發酵劑對發酵香腸中有害生物胺變化規律的影響Table 1 Effects of different starter cultures on changes of biogenic animes in fermented mutton sausages

注：同一行(列)相同小(大寫)寫字母表示差異不顯著，p>0.05；不同則表示差異顯著，p<0.05,“—”表示無檢出。

2.5 不同發酵劑對羊肉香腸中游離脂肪酸影響

香腸中游離脂肪酸的形成受到加工工藝溫度、發酵pH值、濕度等條件影響。所添加發酵劑具有分解生成有機酸、脂肪酸等酶系，可生成有機酸降低肉制品pH值，同時與內源脂酶可將產品中脂肪分解為短鏈揮發性脂肪酸、醛、酯等賦予發酵肉制品特有風味[24]，還可促進飽和脂肪降解、加速單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的釋放[25]。

圖5表明，發酵過程中對照組飽和脂肪酸(SFA)含量增加速率>單一組>復配組，3組SFA由原料肉中15.26 mg/kg左右分別增至發酵結束時24.97、21.40、16.13 mg/kg，可能添加的清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌發酵劑在發酵期間大量繁殖促使飽和脂肪酸轉化或分解[26]，導致發酵劑組SFA含量增加速率較為緩慢；在3～9 d干燥成熟過程各組SFA含量均下降，9 d末復配組含量顯著低于其他2組(p<0.05)；成品貯藏期間SFA含量整體有所下降。

圖5 不同發酵劑對發酵羊肉香腸SFA含量的影響Fig.5 Effects of different starter cultures on the SFA in the fermented mutton sausages

圖6表明，發酵劑組單不飽和脂肪酸(MUFA)含量在制作過程一直呈上升趨勢，而對照組則在貯藏期含量呈下降趨勢。對照組MUFA含量9 d末達到最高(52.77 mg/kg)，顯著高于此時單一組33.60mg/kg和復配組31.60 mg/kg；通過比較3組MUFA含量變化，可知在0～23 d對照組含量一直高于單一組和復配組，而單一組與復配組MUFA含量差異不顯著(p>0.05)，可能是由于內源脂肪酶對MUFA的釋放起到主要作用，這一結果與沈清武研究相一致[25]。

圖6 不同發酵劑對發酵羊肉香腸中MUFA含量的影響Fig.6 Effects of different starter cultures on the MUFA in the fermented mutton sausages

由圖7可知，在干燥結束前，多不飽和脂肪酸(PUFA)釋放速率：對照組>復配組>單一組，說明香腸在干燥前期內源酶對PUFA釋放起主要作用；成熟及貯藏過程，復配組PUFA釋放速率顯著快于其他2組(p<0.05)，說明木糖葡萄球菌對脂肪水解主要發生在香腸成熟過程。綜觀圖6和圖7可知，MUFA釋放速率及累積量>PUFA。通過圖5、6和7可知，復配組香腸在成熟后期：MUFA含量>PUFA>SFA；單一組與對照組：MUFA含量> SFA> PUFA。說明，添加清酒乳桿菌和木糖葡萄球菌復合發酵劑有助于羊肉香腸中不飽和脂肪酸積累和SFA降解。

圖7 不同發酵劑對發酵羊肉香腸中PUFA含量的影響Fig.7 Effects of different starter cultures on the PUFA in the fermented mutton sausages

3 討論

本試驗共為3組，即對照組、單一發酵劑組和復配發酵劑組。對照組與發酵劑組區別在于是否添加外源發酵劑，通過這一設計目的是探究發酵劑對發酵羊肉香腸中有害生物胺含量控制及游離脂肪酸釋放的影響。微生物在適宜條件下分解碳水化合物快速產酸，1.5 d發酵結束，復配組pH值顯著低于單一組和對照組(p<0.05)，說明添加復配發酵劑有利于縮短香腸發酵周期。隨著香腸pH值降低，致使蛋白質束縛水分能力下降，發酵劑組Aw下降速率快于對照組；可能由于香腸肉餡表層水分擴散速率高于內層，導致表層較為干燥，限制了中心水分向外層遷移速率，使香腸干燥成熟后期Aw下降速率較為緩慢。pH、Aw下降也抑制硝酸鹽還原酶活性，在9～37 d復合發酵劑促使復配組亞硝酸鹽含量急劇降低，使得復配組亞硝酸鹽殘留量遠低于國家規定30 mg/kg。

通過探究內源酶和微生物發酵劑對蛋白質分解指數(PI)、有害生物胺含量控制和游離脂肪酸釋放影響可知：3組PI在0.5～9 d呈現上升趨勢，此過程內源蛋白酶與發酵劑蛋白酶系共同作用蛋白質分解。9 d末復配組腐胺、組胺含量遠低于其他2組(p<0.05)，酪胺在9～37 d急劇下降，37 d末含量顯著低于對照和單一組(p<0.05)。在3～37 d，復配組SFA含量<對照組，說明添加清酒乳桿菌與木糖葡萄球菌復配發酵劑可有效降低香腸中SFA含量；0～37 d發酵劑組MUFA含量逐漸上升，0～23 d對照組含量高于單一組和復配組，說明原料肉中內源脂酶對MUFA貢獻高于清酒乳桿菌和木糖葡糖球菌；6～9 d復配組PUFA含量高于其他2組，說明復合發酵劑此時有利于促進PUFA生成。

4 結論

綜上可知，添加復配發酵劑不但有利于縮短香腸發酵周期、快速降低水分含量，更有助于抑制和降低香腸中亞硝酸鹽及有害生物胺含量，也有助于香腸不飽和脂肪酸釋放和飽和脂肪酸的降解。從而利用復合發酵劑有利于提高發酵香腸營養品質和安全性。