牡蠣肽和三文魚皮膠原肽低致敏性和抗過敏活性研究

方磊，李國明，徐珊珊，王憬，馬勇，蔡木易，谷瑞增，魯軍

(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京，100015)

免疫是人體的一種生理功能，人體依靠這種功能識別“自己”和“非己”成分，從而破壞和排斥進入人體的抗原物質。正常情況下，人體免疫系統會對異己抗原排異，抗感染，消除衰老、損傷的細胞；當免疫系統失調時，就會出現反應低下，有時甚至反應過激，引起變態反應，造成機體對自身的傷害[1]，這種變態反應就是過敏，主要由IgE介導[2]，其臨床癥狀主要有：腹瀉、蕁麻疹、發熱、嘔吐等等，嚴重情況下還可能造成虛脫和休克，甚至會危害生命，威脅著易過敏人群的身體健康[3-4]。根據國外流行病學的調查資料顯示：全球大約有6%的兒童和3%～4%的成年人會對一種或者幾種食物過敏，且發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[5]，因此國內外都在致力開發低過敏性或者具有抗過敏性的食品、保健食品和醫療藥品。

1999年國際食品法典委員會第23次會議上，公布了八大類主要過敏食物，分別為魚類、甲殼類、奶類、蛋類、花生、大豆、小麥、堅果類，并認為 90%以上的食物過敏反應均是由以上八大類食物引起的，其中水產品就占2類，當這些食物中的過敏蛋白與體內的IgE相互結合后就會觸發過敏反應，因此，研究食物過敏的機理，通過部分或全部消除過敏原而降低食物過敏的發生率具有重要的社會意義。常見食物過敏原脫敏方法主要有加熱、酶解、輻射等。熱處理可以使過敏原的蛋白結構發生變化，使其空間抗原表位發生改變或者破壞，從而在一定程度上降低或祛除致敏性。史曉霞等[6]研究發現經不同溫度熱處理后的卵類粘蛋白二級結構的α-螺旋，β-折疊、β-轉角以及無規卷曲之間相互轉化導致其過敏原性變化；酶解會使蛋白質的肽鏈發生斷裂，生成分子質量更小的多肽或游離氨基酸，破壞過敏原表位原有的空間結構，從而降低其過敏性。王麗娟等[7]利用木瓜蛋白酶水解凡納濱對蝦蝦肉及蝦蛋白，發現酶解產物致敏性明顯降低，但未能完全消除。食源性低聚肽是以動植物食物蛋白為材料，經過酶解、分離純化、噴霧干燥得到的低聚肽混合物。低聚肽的分子質量大部分在1 000 u以下，遠遠小于蛋白質的分子質量，主要以二肽或三肽為主，比游離的氨基酸更容易被人體吸收，具有促消化吸收、降膽固醇、抗氧化等一系列的營養價值與生理功能[8]。近幾年研究發現，一些小分子質量的低聚肽對透明質酸酶的活性具有一定的抑制作用，從而起到抗過敏的作用，可以改善易過敏人群的飲食條件[9]。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽都是通過酶解蛋白制成的小分子質量低聚肽，但是關于二者致敏性和抗過敏性的研究報道卻很少見，故本文采用酶聯免疫吸附法(ELISA)和透明質酸酶抑制法檢測牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的致敏性和抗過敏性，為低致敏和抗過敏食品和藥品的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽、三文魚皮膠原肽、玉米肽、小麥肽分別來源于牡蠣肉、三文魚皮、玉米蛋白和小麥蛋白，中食海氏生物科技有限公司；牡蠣肽-1、牡蠣肽-2、三文魚皮膠原肽-1、三文魚皮膠原肽-2四種寡肽，吉爾生化(上海有限公司)；2個牡蠣過敏血清編號1-2、2個三文魚過敏血清編號3-4和2個陰性血清，Plasmalab公司；透明質酸酶、透明質酸鈉，SIGMA公司；對-二甲氨基苯甲醛(P-DAB)，南京化學試劑股份有限公司；其余藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

DU-20恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；L-8900日立全自動氨基酸分析儀，天美(中國)科學儀器有限公司；酶標儀，Dynex Spectra Mr；Vivaflow 50超濾器，賽多利斯公司；LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司；色譜柱，TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，日本TOSOH公司。

1.3 試驗方法

1.3.1低聚肽的純化

分別稱取10 g牡蠣肽、三文魚皮膠原肽溶解于100 mL蒸餾水中，用Vivaflow超濾器超濾去除低聚肽中的大分子組分，并將剩余組分冷凍干燥保存。

1.3.2低聚肽的氨基酸組成測定

參考GB/T 5009.124—2003[10]方法，采用L-8900日立全自動氨基酸分析儀進行測定。

1.3.3分子質量分布的測定

采用高效凝膠過濾色譜法測定分子質量的分布：按照林峰等[11]選取的色譜條件制作相對分子質量校正曲線，然后將牡蠣肽和三文魚皮膠原肽用流動相配成1 mg/mL的溶液，經聚四氟乙烯過濾膜(孔徑0.2 μm)過濾后，上樣進行高效凝膠過濾，使用GPC軟件對色譜圖進行分析。

1.3.4低聚肽的抗過敏活性檢測

0.25 mmol/L CaCl20.1 mL加入0.5 mL透明質酸酶溶液(50 mg透明質酸酶溶于20 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液中，pH 4.01)37 ℃培養20 min；分別加入4種食源性低聚肽不同濃度的溶液，各加入0.5 mL，37 ℃保溫20 min；然后在加入0.6 mL透明質酸鈉(0.6 mg/mL)37 ℃保溫20 min；加入0.4 mol/L NaOH 1 mL,迅速置于冰上冷卻15 min；加入0.2 mL硼酸，沸水水浴3 min，立即冰水冷卻5 min，加入P-DAB試劑3 mL，37 ℃保溫20 min，顯色，在585 nm下測定OD值[12]。

抗過敏活性計算：

(1)

式中：A,對照溶液(酶+緩沖液+底物)的OD值;B,對照空白(緩沖液+緩沖液+底物)的OD值;C,樣品(酶+樣+底物)的OD值;D,樣品空白對照(緩沖液+樣+底物)的OD值。

1.3.5低聚肽的致敏性檢測：

按照ABRAMOVITCH等的方法[13]進行適當的調整，取96孔酶標板，將低聚肽溶液用CBS包被液稀釋至5 μg/mL，每孔加100 μL至酶標板中，4 ℃包被過夜，用300 μL PBS-T(含有0.05%的Tween 20)緩沖液洗滌5次，以下所有的洗滌方式都以相同的方式進行；將抗原包被的96孔板在37℃下用300 μL PBS-T稀釋的5%脫脂奶粉封閉1 h，并洗滌；向該板中加入100 μL用1%脫脂奶粉稀釋的血清，然后在室溫下搖動(45 r/min)孵育3 h，然后洗滌；再向每孔中加入100 μL二抗，將平板在室溫下輕輕晃動孵育1h，將平板用PBST洗滌5次，然后再用PBS洗滌3次；再向每孔中加入200 μL的TMB顯色液，室溫避光孵育30 min，然后加入50μL 2mol/L H2SO4終止反應，隨后在酶標儀上450 nm處讀出吸光值，所有ELISA重復3次。

1.3.6寡肽的抗過敏活性檢測

按照2.4的方法，對4個不同寡肽的抗過敏活性進行測定。

1.3.7寡肽的致敏性檢測

按照2.5的方法，對4個不同寡肽的致敏性進行測定。

1.3.8統計學處理

實驗均重復3次，采用Origin 8.0軟件對試驗數據進行統計學處理，采用單因素方差分析，若t檢驗，p<0.05，則證明數據差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 低聚肽的氨基酸組成

牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的氨基酸組成和含量如表1所示，牡蠣肽中天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸的含量較高，總含量為58.07%(質量分數)；富含人體必需的7種氨基酸(不含色氨酸)和2種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸)，含量分別為33.20%和8.92%(質量分數)，兩者占氨基酸總和的42.12%(質量分數)；三文魚皮膠原肽中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的含量較高，總含量為65.18%(質量分數)；富含人體必需的7種氨基酸(不含色氨酸)和兩種半必需氨基酸，含量分別為22.48%和10.82%(質量分數)，兩者占氨基酸總和的33.30%(質量分數)；從整體氨基酸組成來看：牡蠣肽中含有較多的疏水性、酸性和堿性氨基酸，而三文魚皮膠原肽中親水性氨基酸較多；以上表明：2種食源性低聚肽含有多種氨基酸且含量豐富，具有很高的營養價值，是人體補充必需氨基酸的重要來源。

表1 牡蠣肽、三文魚皮膠原肽的氨基酸含量Table 1 The amino acid content of oyster peptides and Salmon skin collagen peptide

2.2 低聚肽的分子質量分布

牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質量分布范圍通過高效凝膠過濾色譜法測定：2種低聚肽的凝膠色譜圖如圖1所示，用GPC分析軟件計算得到牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質量分布范圍，結果如表2所示；牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質量主要分布在1 000 u以下，其中牡蠣肽含量為88.54%、三文魚皮膠原肽含量為88.53%，分子質量在10 000 u以上的蛋白含量很低，其中三文魚皮膠原肽的分子質量在10 000 u以上的含量為零，有研究報道[14]：分子質量較高的蛋白如人血清白蛋白或球蛋白、轉鐵蛋白等大分子蛋白可以增強透明質酸酶的活性。

圖1 牡蠣肽和三文魚皮膠原肽色譜圖(220nm)Fig.1 Oyster peptide and Sphinx skin peptide chromatogram (220nm)

由表2可以看出2種食源性低聚肽的分子質量在140～500 u范圍內的肽段含量最高，分別占比52.74%和50.71%，占據了1 000 u以下分子質量的大部分，而分子質量在該范圍內主要是二肽和三肽。從蛋白質和肽的吸收角度講，人體從胃腸部位吸收二肽或三肽是一種重要的生理現象，且多數氨基酸是以寡肽形式被吸收的[15]。MAEBUCHI等[16]研究表明：蛋白質經酶解后形成的二肽和三肽可以不經消化，能夠迅速被吸收，比游離氨基酸的吸收率提高2～2.5倍，具有更高的營養價值和生理功能[17]。

表2 低聚肽的分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of oligopeptides

2.3 低聚肽的抗過敏活性

低聚肽的抗過敏活性通過透明質酸酶抑制法來測定，并以2種植物食源性低聚肽(小麥肽和玉米肽)做對照，比較不同低聚肽的抗過敏活性。由圖2可知，4種低聚肽的抗過敏活性高低順序為：牡蠣肽>膠原肽>小麥肽>玉米肽，牡蠣肽的抗過敏活性最高，牡蠣肽的質量濃度為60 mg/mL時可以抑制50%以上的透明質酸酶的活性，相同質量濃度的膠原肽和小麥肽分別可以抑制35%和33%以上的透明質酸酶活性，玉米肽的抗過敏活性最低。

圖2 食源性低聚肽對透明質酸酶抑制作用Fig.2 Food-borne oligopeptide on hyaluronidase inhibition

桂枝提取物可以有效抑制透明質酸酶活性[18]，且抗過敏活性和抗氧化活性有很好的正相關性，牡蠣肽和三文魚皮膠原肽具有較強的抗氧化作用[19-20]，0.529 mg/mL的牡蠣肽以及14.95 mg/mL的三文魚皮膠原肽就可以抑制50%的羥基自由基，故2種低聚肽的抗過敏活性較高。抗過敏活性與低聚肽的分子質量大小呈負相關，分子質量小于1 000 u的肽段對透明質酸酶的抑制作用最大，抗過敏活性最強[9]。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質量分布試驗表明，分子質量小于1 000 u的肽段含量高達88.5%以上，能夠最大程度的抑制透明質酸梅的活性，從而起到抗過敏的作用。

2.4 低聚肽抗過敏活性劑量效應曲線

由圖3可以看出，4種低聚肽的抗過敏活性均呈現一定的量效關系，在試驗濃度范圍內，抗過敏活性隨著濃度的增加而提高。其中，牡蠣肽的抗過敏活性最強，玉米肽的抗過敏活性最弱。經過計算，牡蠣肽、三文魚皮膠原肽、小麥肽和玉米肽的IC50值分別是51.57、79.37、89.57和107.01 mg/mL。

圖3 低聚肽對透明質酸酶抑制作用的劑量-效應關系Fig.3 The dose-effect relationship of oligopeptide on hyaluronidase inhibition

雖然目前市場上有關抗過敏的藥物很多，主要分為化學藥物以及天然藥物，尤以化學藥物居多，但是化學藥物的作用很強，一般會引起副作用，會損害人體的健康。天然藥物是直接從天然植物中提取分離獲得的，抗過敏效果明顯，相對于化學藥物對人體的影響較小，但是由于天然藥物的成分比較復雜，目前的分離分析水平又不能完全分離這些復雜的化合物，給天然藥物的分離制備帶來很大的困難。與這些抗過敏藥物相比，牡蠣肽和膠原肽的抗過敏活性要低很多，但是這2種低聚肽是來自食物蛋白質，成分明確，制備工藝比較成熟，具有較高的安全性，并且作用溫和，不會產生咳嗽 、皮疹、腎臟毒害，味覺失調等毒副作用，可長期食用[21]。

2.5 低聚肽的低致敏性分析

采用ELISA法分析低聚肽的低致敏性，結果如圖4和圖5所示。

圖4 牡蠣肽對血清IgE反應性Fig.4 Oyster peptide on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(牡蠣蛋白0.445，牡蠣肽0.323),與牡蠣蛋白相比，*表示p<0.05差異顯著。

圖5 三文魚皮膠原肽對血清IgE反應性Fig.5 Trichosanthin collagen peptide on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(三文魚蛋白0.315，三文魚皮膠原肽0.181)，與三文魚皮蛋白相比，*表示p<0.05差異顯著。

牡蠣肽和三文魚皮膠原肽比相應的蛋白質具有較低的IgE反應性。與牡蠣蛋白相比，牡蠣肽對每種血清的IgE反應性顯著降低(p<0.05)，且與血清2反應的OD450值要低于陰性血清的OD450值，幾乎沒有致敏性；三文魚皮膠原肽對每種血清的OD450值均高于陰性血清的OD450值，具有致敏作用，但是與三文魚蛋白相比其IgE反應性也顯著降低(p<0.05)，由于蛋白質結構發生變化，所以2種低聚肽的致敏作用很低。

致敏性的強弱與過敏原蛋白的氨基酸數目、組成、排列順序以及蛋白的分子構型有關，酶解可使蛋白質的肽鏈發生斷裂，破壞過敏原蛋白原有的空間結構，從而降低其過敏性。蔡木易等[22]發明了一種酶解制備低致敏性的高蛋白牡蠣活性肽的方法，經間接競爭ELISA法測定致敏性發現，牡蠣活性肽的抗原性較牡蠣蛋白降低了80%以上。SHIMALURA等[23]采用胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶P對甲殼動物蛋白進行酶解，發現經過酶解后蛋白質的過敏性幾乎完全消失。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽都是經過酶解蛋白制成的小分子多肽，可能破壞過敏蛋白原有的空間結構，故2種動物源性低聚肽的致敏性較低，是開發低致敏性功能食品的重要來源，可以作為新的功能營養成分應用于食品，保健食品和藥品的開發與生產。

2.6 寡肽的序列及純度分析

寡肽的合成由吉爾生化(上海)有限公司完成，序列見表3；并利用高效液相色譜(HPLC)對合成的寡肽純度進行分析，以牡蠣肽-1為例，結果見圖6，由圖6中可以看出，合成的牡蠣肽-1純度達到99.12%，牡蠣肽-2、三文魚皮膠原肽-1、三文魚皮膠原肽-2的寡肽純度分別為98.13%、98.68%和98.52%。

表3 寡肽的序列及純度Table 3 Sequence and purity of the oligopeptides

圖6 牡蠣肽-1寡肽的HPLC分析Fig.6 HPLC result of Oyster peptide-1

2.7 寡肽的抗過敏活性

4種寡肽的抗過敏活性結果見圖7，從圖7中可以看出，4種寡肽的抗過敏活性高低順序為：牡蠣肽-1>三文魚皮膠原肽-1>牡蠣肽-2>三文魚皮膠原肽-2；4種寡肽的分子質量大小在表3中可知，牡蠣肽-1<三文魚皮膠原肽-1<牡蠣肽-2<三文魚皮膠原肽-2，但4種寡肽的抗過敏活性依次降低，故抗過敏活性與低聚肽的分子質量大小呈負相關；從氨基酸的組成可知，牡蠣肽-1、三文魚皮膠原肽-1、三文魚皮膠原肽-2中含有纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸，均為疏水性氨基酸占比較高，說明寡肽的抗過敏活性與疏水性氨基酸有一定的正相關性；整體來看，牡蠣寡肽的抗過敏活性高于三文魚皮膠原寡肽，與上述3.3中的牡蠣肽抗過敏活性高于膠原肽抗過敏活性的結果一致。MARIA等[24]合成了一種三肽RTY并發現該三肽可有效地抑制肥大細胞脫顆粒及大鼠嗜堿性粒細胞β-己糖胺酶的釋放，降低過敏反應，表明食源性寡肽確實具有一定的抗過敏活性。

圖7 不同寡肽的透明質酸酶抑制作用Fig.7 Different oligopeptides on hyaluronidase inhibition注：與牡蠣肽-1相比，*表示p<0.05，差異顯著。

22.8 寡肽的低致敏性分析

牡蠣寡肽和三文魚皮膠原寡肽的低致敏性結果如圖8、圖9所示，與相應的蛋白質相比，4種寡肽的OD450值均顯著降低(p<0.05)；其中牡蠣肽-2對每種血清的OD450值均大于牡蠣肽-1，這是因為牡蠣肽-2中含有較多的親水性氨基酸，而牡蠣肽-1中疏水性氨基酸較多，有文獻報道[25-26]，食物過敏蛋白的氨基酸序列大多為親水性氨基酸，與血清中的IgE容易結合從而導致過敏反應的發生；因此牡蠣肽-2的致敏作用要高于牡蠣肽-1；三文魚皮膠原肽-1的OD450值小于三文魚皮膠原肽-2，且2種寡肽的氨基酸序列中均以疏水性氨基酸較多，但二者的分子質量差異比較大，導致致敏作用不同；故食源性寡肽的致敏作用與氨基酸的組成和分子質量有一定的相關性。

圖8 牡蠣寡肽對血清IgE反應性Fig.8 Oyster oligopeptides on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(牡蠣蛋白0.445, 牡蠣肽-1 0.472, 牡蠣肽-2 0.515)與牡蠣蛋白相比，*表示p<0.05，差異顯著。

圖9 牡蠣寡肽對血清IgE反應性Fig.9 Trichosanthin collagen oligopeptides on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(三文魚蛋白0.315, 三文魚皮膠原肽-1 0.175, 三文魚皮膠原肽-2 0.206)，與三文魚皮蛋白相比，*表示p<0.05，差異顯著。

3 結論

本研究對牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的氨基酸組成和分子質量分布測定的基礎上，對其抗過敏活性和致敏作用也進行了研究。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的氨基酸組成豐富，富含人體必需氨基酸和半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸)；2種低聚肽的分子質量小于1 000 u的肽段含量高達88.5%以上，主要分布在140～500 u范圍內，以二肽和三肽為主；牡蠣肽、三文魚皮膠原肽與小麥肽、玉米肽4種低聚肽對透明質酸酶都有一定的抑制作用，IC50值分別為51.57、79.37、89.57、107.01 mg/mL，其中牡蠣肽的抗過敏作用最強，膠原肽次之，玉米肽的抗過敏作用最弱；與相應的蛋白質相比，牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的致敏作用均顯著降低。然后選擇4種氨基酸組成和分子質量差異比較大的寡肽進一步研究其抗過敏活性和低致敏作用，發現牡蠣寡肽的抗過敏活性要高于三文魚皮膠原寡肽，且寡肽的抗過敏活性與分子質量呈負相關性，與疏水性氨基酸呈一定的正相關性，4種寡肽的致敏作用也顯著降低，且與氨基酸的組成和分子量有一定的相關性。目前，牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的生產技術已經基本成熟，且成分比較明確，對人體具有較高的安全性，為其作為低致敏和抗過敏成分應用于食品、藥品的開發提供了一定的理論支持，但對于2種低聚肽的體內抗過敏活性及作用機制尚需進一步探討。