5 L發酵罐中棘白菌素B發酵工藝參數優化

胡曉龍，秦海彬，吳旭萍，毛健，鄒樹平，牛坤

(浙江工業大學 浙江省生物有機合成研究重點實驗室，浙江 杭州，310014)

阿尼芬凈是棘白菌素類“王牌抗生素”，能夠非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1, 3-葡聚糖合成酶的活性，從而達到抗真菌的目的[1]。目前該藥物已在美國和歐洲批準上市，而國內尚在臨床階段，無企業生產此類藥物，導致其市場壟斷、價格高，因此對該藥物的高效生產技術進行研發，實現其國產化，將有助于打破國際制藥企業的壟斷，為患者提供價廉質優的抗真菌藥物，具有重要的經濟和社會效益[2]。

該藥物主要通過對棘白菌素B(Echinocandin B, ECB)的脂肪酸側鏈進行修飾替換而得到，因此，ECB是阿尼芬凈的重要前體物質，其發酵產量的高低顯著影響阿尼芬凈的生產成本[3-5]。目前，國內外棘白菌素B均采用微生物發酵法進行制備，其中主要是以工業化的Aspergillusrugulosus菌株和構巢曲霉(Aspergillusnidulans)進行發酵，而目前其發酵產量過低仍是限制阿尼芬凈產業化的關鍵問題。前人對棘白菌素類抗生素的發酵過程已經開展了大量研究，包括溫度、pH值以及培養基組成等。與生產紐莫康定B0和FR901379的發酵過程相似，合成ECB的最適溫度一般為24～28 ℃，而A.rugulosus的最適生長溫度則在37 ℃左右，在ECB最適生產溫度24～28 ℃則生長緩慢，且該菌發酵生產ECB對溫度表現出極高的敏感度，在37 ℃發酵液中幾乎沒有ECB的生成[6-7]。除此之外，ECB的六肽支架結構主要由6個氨基酸組成：4R, 5R-二羥基-L-鳥氨酸、L-蘇氨酸、4R-羥基-L-脯氨酸、3S, 4S-二羥基-L-高酪氨酸、L-蘇氨酸和3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸[1]。因此，在許多文獻中考察了不同氨基酸前體的添加對ECB發酵產量的影響，例如添加15 g/L的L-酪氨酸和L-苯丙氨酸能達到比較好的結果，因為它們可以合成4-羥基-苯基-丙酮酸，是高酪氨酸合成的前體[8]。國內有關發酵制備ECB的文獻較少，上海醫藥工業研究院報道了關于制備ECB的方法，其產量為712 mg/L[9]；華北制藥集團在高純度制備ECB方法的專利中報道ECB產量為750～850 mg/L[10]；2013年上海醫藥工業研究院對ECB的生產方法進行了報道，產量為750～900 mg/L[11]，相對較低的產量也反映出該絲狀真菌在發酵過程中碰到的一些難以克服的技術問題，如發酵液粘度過高，供氧不足以及傳質受阻等，本實驗室也開展了大量工作，通過菌種改造、發酵培養基優化等方法可以使搖瓶發酵過程中ECB產量穩定在2 000 mg/L以上[12-14]。

本文在上述搖瓶發酵的基礎上考察了5 L機械攪拌罐中的發酵情況，對其中影響曲霉生長的主要因素，如攪拌槳類型、攪拌轉速以及通氣量等進行了考察，從而優化ECB在發酵罐中的發酵條件，為后續中試及生產放大提供一定的數據基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌株AspergillusnidulansZJB09223，為本實驗室保藏菌株。該菌株在搖瓶中的發酵產量維持在2 000 mg/L左右。

1.2 培養基

斜面培養基：PDA培養基。

種子培養基(g/L)：葡萄糖10，甘油10，棉籽粉25，pH 6.8～7.0。

發酵培養基(g/L)：花生油20，甘油10，蛋白胨10，L-脯氨酸5，甘露醇100，康明威豆粕40，K2HPO4·3H2O 10，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO4·H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl20.5，CuSO40.6，鳥氨酸6，番茄粉15，pH 7.0。

1.3 培養方法及培養條件

斜面培養：用無菌環從甘油管中挑取少量的孢子接種到新鮮PDA斜面培養基中，25 ℃避光倒置培養12～14 d，菌體顏色由白色變為墨綠色。

種子液培養：從斜面培養基上用無菌接種鏟挑取0.5 cm×1.0 cm左右的菌落接種于裝有種子培養基的三角瓶中(100 mL/500 mL)，置于調速搖床上培養2 d(25 ℃，220 r/min)。

搖瓶發酵培養：將上述種子液按照10%接種量(v/v)接入液體發酵培養基中，220 r/min，25 ℃培養12 d。發酵過程中，發酵液由白色漸漸變成紅色，最后加深變為深褐色。

發酵罐初始培養條件：將培養48 h的種子液按10%接種量(v/v)接種于5 L發酵罐中，于25 ℃，400 r/min，通氣量1.0 VVM，初始pH 6.5的條件下，培養15 d。

1.4 分析方法

生物量(g/L)：取20 mL菌液離心去上清液，菌體放入烘箱90 ℃烘干至衡重，計算得到生物量。

ECB的檢測：ECB采用高效液相色譜儀(LC-2010A，島津)分析檢測，色譜柱為C18柱(大連依利特4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=7∶1∶2；流速1 mL/min；紫外檢測波長222 nm；進樣量20 μL; 柱溫40 ℃。取ECB標品(GC>99 %)，溶于甲醇中，配制成不同濃度的標品溶液，取1mL于液相瓶中進行液相檢測。

發酵液預處理：取1 mL發酵液于2 mL EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清液；剩余菌體加入5 mL甲醇萃取靜置30 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min；取上清用0.22 μm有機膜過濾后，進行液相檢測。

2 結果與分析

2.1 Aspergillus nidulans ZJB09223在5 L機械攪拌罐中的發酵特性

本實驗的發酵液黏度較高，而機械攪拌式生物反應器具有較強的剪切力和傳質速率，因此本研究選用5 L 機械攪拌罐，考察該發酵過程的基本特性。選擇種齡為48 h的種子液、培養溫度25 ℃，pH 6.5的條件下進行培養。在通氣量為1.0 VVM、攪拌轉速400 r/min條件下發酵進程如圖1所示。

圖1 Aspergillus nidulans ZJB09223在5 L機械攪拌發酵罐中的發酵特性Fig.1 Profile of Aspergillus nidulans ZJB09223 fermentation in 5 L mechanical agitating fermentor

從圖1可知，在發酵初期菌絲體即開始大量生長，發酵液中部分菌體附著在固形碳氮源上，形成大小不一的菌絲球，部分菌絲呈絮狀生長，在發酵第4天即達到細胞干重的最大值，89.5 g/L。同時，發酵液黏度不斷增加，溶氧顯著下降到13%左右，發酵液出現白色絮狀菌絲；第4～8天，發酵液中的固形碳氮源被大量消耗，菌絲球減少，大量菌絲體呈絮狀生長，并附著在攪拌槳、發酵罐內壁以及擋板上結塊生長，直到發酵結束菌體量下降至52 g/L左右。在菌體下降的過程中，發酵液顏色由白色變為橘紅和紅棕色，ECB作為次級代謝產物產量逐漸增加，在發酵第14天達到峰值207 mg/L。菌絲破裂釋放胞內酸性物質使pH值緩慢降低，發酵液顏色進一步加深，變為深褐色。與此同時，發酵液中溶氧開始回升至30%左右。

在發酵過程中未調控pH值的情況下，pH值基本維持在6.5左右，而當發酵進行至第11天后，pH值開始呈現緩慢降低，最終降到6.0，這主要是因為細胞破裂，胞內酸性物質的釋放造成的。以上結果表明，生物反應器相比于搖瓶中生產ECB積累有所延遲，其原因可能是在菌體開始大量生長的階段，發酵罐中的溶氧水平較低，菌絲體未達到最佳生長狀態，前體物質合成量不足，而且相關酶進行羥基化效率不高，最終影響了次級代謝產物的生成。另外，在發酵罐中攪拌區域有限，菌絲體會附著在罐壁及發酵罐上部，達不到攪拌效果，無法攝取營養物質合成次級代謝產物，因此，對發酵罐攪拌槳進行改造是十分必要的。

2.2 攪拌槳類型對棘白菌素B合成的影響

目前大多數機械攪拌發酵罐采用徑向流渦輪式攪拌器，但有研究表明，將軸向流的攪拌器應用于真菌發酵有很多優勢，尤其是高密度、高黏度的微生物發酵。與徑向流攪拌器相比，軸向流攪拌器在介質的功率消耗、混合性能或者傳質效果等方面都更優越。本實驗以發酵罐原裝的六直葉圓盤渦輪攪拌器為對照，以初始條件考察了框式攪拌器和雙折葉攪拌器對發酵生產ECB的影響，見圖2。

a-框式攪拌器；b-雙折葉攪拌器圖2 框式攪拌器和雙折葉攪拌器的規格參數Fig.2 Specification parameter of gate agitator and double folded blade agitator

實驗結果如圖3所示，在發酵0～6 d，3種攪拌器對應的反應器中菌絲濃度均快速增長，但是框式攪拌器的攪拌面積大，氣液混合效果更好，第4天生物量可以達到最大值98.5 g/L。相比而言，雙折葉攪拌器表面積較小，在菌體上升一定濃度后已經不太適應較黏稠的發酵液攪拌，生物量增長較慢，菌體最大值僅為86.5 g/L。六直葉圓盤渦輪攪拌器的混合效果介于兩者之間，生物量為94 g/L。在發酵第6～15天，框式攪拌器形成的高剪切力損傷了菌絲體，菌絲濃度快速下降至46.5 g/L，導致產物ECB產量由99 mg/L下降為75 mg/L。而裝有圓盤渦輪攪拌器的發酵罐中的菌絲體受剪切力影響較小，菌絲損傷小，開始大量生成產物，最終產物質量濃度為213 mg/L。雙折葉攪拌器對應的發酵罐中菌絲體受剪切力影響最小，但由于生長前中期發酵液攪拌混合不佳，溶氧水平較低影響了前體物質的合成，導致后期ECB生成能力降低，最終產量僅為106 mg/L。綜上所述，由于絲狀真菌的本身特性使得攪拌槳類型對菌體生長及次級代謝產物的合成具有較大的影響，而本實驗由于時間有限未能得到較優的攪拌槳類型，后續可進一步改善攪拌槳結構，例如，安裝2根獨立的攪拌器，靠近空氣分布器的位置使用高速運轉的六直葉圓盤渦輪攪拌器，有利于打碎氣泡，提高氧傳遞速率。罐身中部使用慢速的軸向流攪拌器，有利于中高黏度液體的混和，強化傳質效果，這樣可能更有利于ECB的發酵生產。

a-棘白菌素B產量；b-菌體干重圖3 攪拌槳類型對棘白菌素B發酵過程的影響Fig.3 Effect of different agitators on ECB fermentation process

2.3 攪拌轉速的優化

對高黏度發酵過程而言，攪拌轉速也是發酵過程的重要參數，本實驗在原有發酵條件下，在300～600 r/min范圍內初步設置4個梯度的恒定轉速，進一步對攪拌轉速控制工藝進行優化。圖4-a顯示攪拌轉速對ECB的產量有較大的影響，從300 r/min開始，隨著攪拌轉速的提升ECB產量也隨之提高，在500 r/min時，產量達到最大值317 mg/L，600 r/min條件下，ECB初期產量較大，第9天以后產量增速放緩，在第11天產物積累的量為193 mg/L，因此，最適恒定攪拌轉速控制于500 r/min，此時ECB產量為317 mg/L，效價比選用六直葉圓盤渦輪攪拌器后提高了47 %。

圖4-b表明在發酵0～6 d，攪拌轉速300～600 r/min范圍內，菌絲體濃度與攪拌轉速成正比，而到發酵后期，除了300 r/min條件外，其他轉速菌絲濃度與攪拌轉速成反比。600 r/min條件下第0～6天菌絲體濃度較高，達到103 g/L，第7天后開始下降，這可能是由于在菌絲衰亡期，攪拌速度過快會造成剪切力較大，對菌絲形態造成損傷，致使產物代謝異常，產量降低。攪拌轉速為400 r/min時，由于發酵第0～6天菌絲體生長沒達到最佳狀態，中間產物積累較少，即使后期菌絲濃度有所增加，產物產量仍然很低(215 mg/L)。攪拌轉速為300 r/min時，發酵液混合不均勻，攪拌效果不佳，靠近發酵罐外壁的發酵液黏度高，導致ECB菌絲體濃度和產量均處于較低水平。

a-棘白菌素B產量；b-菌體干重圖4 不同攪拌轉速對棘白菌素B發酵過程的影響Fig.4 Effect of different stirring speed on ECB fermentation process

在研究恒定轉速對ECB發酵過程的影響時發現，第0～8天，600 r/min的條件下菌絲體濃度最大，但是發酵結束時產物的產量較低，僅為175 mg/L，說明該條件是菌絲體生長的最適攪拌轉速而不是產物合成時的最適攪拌轉速。由于菌絲體在發酵后期第7～15天對剪切力較為敏感，如果在最適菌絲體濃度下，適當降低攪拌轉速可能有利于ECB產量的提高。因此設計了如下幾組實驗進行比較：(1)攪拌轉速由600 降至500 r/min；(2)攪拌轉速由600降至400 r/min；(3)攪拌轉速由600 r/min降至300 r/min；(4)攪拌轉速恒定500 r/min。發酵第6天改變轉速，其中最適的恒定攪拌轉速500 r/min作為對照組。實驗結果見圖5。

a-棘白菌素B產量；b-菌體干重圖5 分階段控制攪拌轉速對棘白菌素B合成的影響Fig.5 Effect of control agitator speed at different stages on ECB fermentation process

在第0～6天菌絲體生長和穩定階段，提高攪拌轉速菌絲體濃度有一定上升，攪拌混合效果較好，中間代謝產物大量積累，對最終產物的合成有積極的影響。在第6～15天產物大量合成階段，將攪拌轉速適當降低至500 r/min，有利于ECB產量的提高，如果轉速降低至300 r/min，會導致發酵液中溶氧水平下降，ECB產量僅為288 mg/L。實驗結果表明，在第0～6天攪拌轉速控制600 r/min，第6～15天攪拌轉速降至400 r/min，有利于產物生成，ECB產量可以達到462 mg/L，比對照組提高了44%。采用分階段控制攪拌轉速，一方面可以提高ECB的產量，另一方面也關系到工業化生產的能耗，因此后續可以進一步優化改變轉速的時間點，以確定既能提高產物產量又能節省能耗的調控策略。

2.4 通氣量的優化

影響產量的因素除了剪切力，溶氧也是重要因素。氧氣是氧化磷酸化過程中最終的電子受體，發酵前期溶氧不足時，NADH氧化成NAD+的過程受阻，導致NADH的積累，減少了ATP的合成，而且包括菌體生長在內的生理生化反應都受到影響。到發酵中后期，由甘露醇提供的NADPH為加氧酶提供修飾六肽環的能量，次級代謝產物大量合成，此時溶氧不足會直接影響產物的產量[15]。因此，本實驗在控制攪拌轉速的前提下，進一步研究溶氧對ECB合成的影響。實驗分別考察了1.0～2.0 VVM通氣量對ECB合成的影響，結果如圖6所示。

a-棘白菌素B產量；b-菌體干重圖6 不同通氣量對棘白菌素B合成的影響Fig.6 Effect of different ventilation on ECB fermentation process

實驗結果表明，不同的通氣量對菌體生長和ECB合成的影響趨勢基本相同，通氣量的增加可以明顯提高菌體的生物量，在1.0～1.7 VVM范圍內，隨著通氣量的增加菌絲體最高生物量由98.5 g/L上升到106.5 g/L，有較大提高，再進一步增加到2 VVM時，菌體量基本保持不變。就ECB發酵產量而言，隨著通氣量的提高，其產量也有所增加，在1.7 VVM時達到608 mg/L，比1.0 VVM條件下提高32%。而在通氣量為2 VVM時，過大的通氣量容易使發酵液噴射到發酵罐罐頂內壁上，菌體在上部大量生長容易堵住補水孔及出氣孔，增加罐壓及染菌風險，而且增加了能耗，因此，綜合考慮以上情況，在5 L發酵罐中使用1.7 VVM恒定通氣量。

綜上所述，ECB在發酵罐中產量遠低于搖瓶中產量(2 000 mg/L)，主要原因是兩者發酵液傳質方式和溶氧水平有差異。ECB在搖瓶中發酵時，發酵液振蕩混合均勻、溶氧充分；而在發酵罐中由于生長對數期發酵液粘稠，雖然靠近攪拌槳處發酵液攪拌充分，而遠離攪拌槳處發酵液流動緩慢傳質效果不佳，發酵液混合不均勻導致氧氣在發酵液中分布不均，不僅致使ECB產量減少而且延長了ECB發酵周期。另外，攪拌槳的高速運轉在一定程度上損傷了菌絲體，使得細胞干重比搖瓶中要低，從而導致ECB產量的降低。

3 結論

實驗對AspergillusnidulansZJB09223在5 L機械攪拌發酵罐中的培養條件進行了初步探索，為ECB發酵過程的放大探明基本條件及影響因素。通過攪拌槳類型的對比，發現在本實驗條件下六直葉圓盤渦輪攪拌器更適合發酵生產ECB，而后續應該繼續在攪拌槳類型方面進行研究，從而獲得最優的攪拌條件。從ECB發酵產量和生產能耗角度以及菌體發酵過程中的代謝規律考慮，建立了兩階段攪拌轉速控制方式，在1.7 VVM通氣條件下，發酵第0～6天，攪拌轉速控制600 r/min，發酵后期第6～15天，攪拌轉速降為400 r/min，可使ECB發酵產量提高至608 mg/L。雖然該產量比未優化前提高了193 %，但相比搖瓶發酵水平仍有較大差距，因此，在后續ECB發酵放大過程中，需要綜合考慮攪拌傳質及溶氧對ECB發酵過程的影響，以進一步提高發酵罐中的發酵水平。