不同植物多酚對雞肉餅冷藏過程中N-亞硝胺含量影響

武思敏，黃莉，2*，任曉云，劉俊麗，王興瑞，閆瑾，張丹，張叢叢

1(濱州學院 生物與環境工程學院，山東 濱州，256600) 2(山省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州，256600) 3(濱州出入境檢驗檢疫局技術中心，山東 濱州，256600)

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

選擇50只14日齡白羽肉雞，分成5組，每組10只，飼喂于山東綠都生物科技有限公司。從第21天～第42天在飼料中分別添加200 mg/kg VE(純度98%)、110 mg/kg綠原酸和兒茶素(純度90%)、167 mg/kg鼠尾草酸(純度60%)，分別為VE組、綠原酸組(chlorogenic acid，CHA)、兒茶素組(catechin，CAT)、鼠尾草酸組(carnosic acid, CAR)和空白組(control)。在第43天將肉雞宰殺后取雞胸肉和雞腿肉，用保溫箱加冰塊運回實驗室，放在冰箱冷藏24 h開始制樣；食鹽、十三香均購于濱州市全福元超市；復合磷酸鹽、亞硝酸鈉購于濱州市霞光食品添加劑有限公司。

1.1.2 試劑與設備

兒茶素(EGCG)、鼠尾草酸、綠原酸、VE，南京道斯夫生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼、鹽酸胍等試劑為生化試劑，二氯甲烷等為分析純，均購于濱州市泰達試劑商貿公司；N-甲基亞硝胺、N-乙基亞硝胺標準品，上海安譜實驗科技股份有限公司。亞硝酸鹽試劑盒，南京建成悅浩科技有限公司。

DZ-600/2S型真空包裝機,諸城市天順機械有限公司；FJ200-SH數顯分散均質機,上海標本模型廠；SM-G73絞肉機,廣州新域機電制造有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；低溫離心機,賽默飛世爾科技中國有限公司；雷磁PHS-3C pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司；氣相色譜—質譜聯用儀(Agilent 7890A-5975C)，美國安捷倫科技有限公司；旋轉蒸發儀,上海愛明儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

取解僵后的雞胸肉(870 g)、雞腿肉(435 g)、雞脂(145 g，添加比例為雞肉的10%)使用絞肉機絞碎，粒度直徑為 5.6 mm，復合磷酸鹽(4.35 g)、十三香粉(11.6 g)、亞硝酸鈉(0.195 7 g)、食鹽(29 g)，拌成肉餡并制成肉餅，立即裝袋后進行真空包裝，于 4℃冰箱中冷藏。

1.2.2 基本成分測定

蛋白質含量測定參照國標GB 5009.5—2016測定，取樣量為0.50 g。水分含量測定采用水分測定儀，準確稱取1.00 g雞肉餅，在105 ℃將其烘干至恒重。脂肪含量：參照國標GB/T 5009.6—2003，將樣品干燥后采用石油醚索氏抽提。灰分含量：參照國標GB 5009.4—2016，取樣量為1.00 g。

1.2.3 羰基值的測定

取1.00 g雞肉餅，加入10 mL 20 mmol/L PBS(pH 6.5，內含6 mol/L NaCl)于50 mL離心管中，高速均質30 s，分別取4等份0.2 mL均質液于10 mL離心管中，每管分別加入1 mL 10% TCA，并于4 200×g離心5 min，用以沉淀蛋白。測定羰基的步驟與XIA[10]的方法相同。羰基蛋白濃度測定采用紫外分光光度法，標準曲線為y=0.584 7x-0.001 3(R2=0.999 3)。羰基值用nmol/mg蛋白表示，計算公式如下：

(1)

其中：C蛋白濃度,測定用樣液蛋白質量濃度,mg/mL；22 000，羰基的摩爾吸光系數。

1.2.4 TBARS值的測定

參照SINNHUBER和YU[11]的方法，并作適當的修改。取2.00 g雞肉餅于15 mL帶塞離心管中，加入1.5 mL TBA以及7.5 mL三氯乙酸-鹽酸溶液，充分振蕩待混勻后于100 ℃水浴30 min，待其冷卻后，取出4.5 mL樣液，并加入4.5 mL三氯甲烷，于1 000×g離心10 min，離心后再次振蕩混勻，相同條件下再次離心，在532 nm處比色，使用三氯乙酸-鹽酸溶液調零，讀取吸光值。計算公式如下：

(2)

其中：m,測定所需雞肉餅質量,g；Abs532,測定樣液吸光值；9.48,常數。

1.2.5 pH的測定

取5.00 g雞肉餅，加入45.0 mL蒸餾水，使用均質機高速勻漿，測定勻漿液的pH值。

1.2.6 保水性的測定

根據LIU等[12]的方法并稍作修改。取5.00 g雞肉餅樣品(m0)，置于50 mL離心管中，于4 ℃ 2 000×g離心20 min。準確稱取離心后肉樣質量(m1)。另取1.000g雞肉餅肉樣于水分測定儀中(m2)，在105 ℃下干燥直至恒重(m3)。計算公式如下：

(3)

其中：m0,雞肉餅離心前的質量，g；m1,雞肉餅離心后的質量，g；m2,雞肉餅干燥前的質量，g；m3,雞肉餅干燥后的質量，g。

1.2.7 亞硝酸鹽殘留量的測定

參照GB 5009.26—2016，稱取5.00 g雞肉餅，加入10 mL蒸餾水，經高速勻漿制成勻漿液，取0.4 mL于10 mL離心管中，取兩只空管，一只為空白管，另一只為標準管，每管分別加入0.4 mL蒸餾水、0.4 mL 100 μmol/L 亞硝酸鈉。隨后，每管分別加入0.8 mL 1號試劑、0.4 mL 2號試劑，混勻后放置10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液0.8 mL用以顯色。每組加入顯色劑0.4 mL，混勻，于15 min后在550 nm處用0.5 cm比色杯比色，蒸餾水調零。計算公式如下：

(4)

式中：C[標準品]，標準品濃度，100 μmol/L;n,樣品稀釋倍數。

1.2.8N-亞硝胺含量的測定

參照國標GB/T 5009.26—2003測定，取樣量為200.00 g。分析條件：載氣： 氦氣，純度大于等于99.999%； 流速：1.0 mL/min；色譜柱 DB-5MS(30 m×0.25 mm)；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1.0 μL；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫條件：70 ℃保持5 min,再從20 ℃升到240 ℃。

1.3 數據統計分析

每個試驗重復3次，結果表示為平均數±SD。數據統計分析采用Statistix 8.1 (分析軟件, St Paul, MN) 軟件包中Linear Models程序進行，差異顯著性(p<0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 植物多酚對雞肉的基本成分的影響

由表1可以看出，日糧添加植物多酚對雞肉(餅)中蛋白質、脂肪及灰分的含量均沒有顯著影響，雞肉餅中的蛋白質含量為16%～17%，粗脂肪含量為9.5%～10%之間，灰分含量為5.2%～5.6%。總體上看兒茶素組蛋白質和脂肪含量偏低，鼠尾草酸組含量偏高一點。因各組中配方及所添加輔料均是相同的，所以各組雞肉餅成分的差別應來源于雞肉。據報道，茶多酚(兒茶素)可以提高動物的生長性能[13]，但對雞肉基本成分的影響未見報道，這可能與植物多酚在動物體內的代謝有關，還需進一步探討。

表1 雞肉餅基本成分Table 1 Proximate composite of chicken pie

注：具有相同的字母(A)表示日糧添加不同的植物多酚的雞肉基本成分差異不顯著 (p>0.05)。

2.2 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中抗氧化作用影響

TBARS值可表征雞肉餅在冷藏過程中的脂肪氧化程度，羰基值可表征其蛋白氧化程度。由圖1可以看出，雞肉餅在冷藏過程中發生了明顯的脂肪氧化，TBARS值整體上呈現快速增加的趨勢，羰基值也呈現出后期快速增加的趨勢。雞肉餅的初始TBARS在0.016～0.058 9 mg/kg，富含植物多酚的雞肉餅在冷藏過程中均表現出一定的抗氧化效果，抗氧化能力大小依次為：鼠尾草酸>兒茶素>VE>綠原酸。這與畢田田等[14]在研究鼠尾草酸LDPE活性膜對新鮮雞肉丸品質特性中的結果一致。賈娜等[15]在雞肉糜中添加迷迭香提取物(鼠尾草酸是迷迭香提取物的主要成分)，也證實迷迭香提取物能夠顯著地抑制雞肉糜的脂肪氧化。同樣地，雞肉餅的初始羰基值在0.82～1.41 nmol/mg，雞肉餅中的羰基含量在冷藏的前7 d沒有明顯的變化(p>0.05)，但隨著冷藏時間的延長，羰基含量開始快速增加并達到最大值。與對脂肪氧化抑制的效果相似，鼠尾草酸的抗氧化能力最強，其次是兒茶素和VE，綠原酸再次之。曹云剛[16]也證實植物多酚對蛋白氧化的抑制效果與對脂肪氧化抑制效果呈正相關。醛類是脂肪氧化的主產物，是蛋白羰基共價結合的一個重要來源產物的前體物。因此，植物多酚對雞肉餅的蛋白氧化和脂肪氧化抑制作用具有一致性。

圖1 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中TBARS和羰基值的影響Fig.1 Effect of plant polyphonel on TBARS and carbonyl content of chicken pie during the refrigeration注：具有不同的字母(A～E)表示添加相同的植物多酚的雞肉餅在不同冷藏時間內差異顯著 (p<0.05)；具有不同的字母(a～b)表示添加不同植物多酚的樣品在相同冷藏時間內差異顯著 (p<0.05)，下同。

2.3 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中pH值的影響

由圖2可以看出，雞肉餅的最初 pH值為6.40左右，在雞肉餅的冷藏過程中，pH值呈先上升后下降整體趨勢，與梁慧對三黃雞肉的pH值變化趨勢基本相同[17]。最初階段pH 值升高可能是由于蛋白被降解產生非蛋白態氮導致；pH值下降可能是由于乳酸菌開始繁殖，導致雞肉餅pH逐漸下降。從第3天開始，pH值逐漸上升，直到第7天pH值達到又一個峰值，這可能與肉制品本身的作用和配料的添加有關；第7天以后pH繼續下降，這可能是因為隨著冷藏時間的延長，雞肉餅中的微生物不斷繁殖，雞肉中的蛋白質、脂肪被微生物分解，產生酸性物質，導致雞肉餅中的pH值不斷降低。VE組下降幅度與富含3種多酚的雞肉餅有較大差異，此時，與空白對照組相比，含有綠原酸和鼠尾草酸的雞肉餅pH略低，而含有兒茶素的雞肉餅pH略高，這可能與兒茶素的抑菌作用較強有關，本研究中使用的是酯型兒茶素(EGCG)，對細菌的抑制作用較強，具有廣譜性和高效性[18]。

圖2 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中pH值的影響Fig.2 Effect of plant polyphonel on pH of chicken pie during the refrigeration

2.4 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中保水性的影響

由圖3可以看出，雞肉餅的保水性在整個冷藏過程中呈下降趨勢，由最初的82.26%～85.49%下降至第21天的66.55%～78.14%，冷藏時間對雞肉餅的影響很顯著(p<0.05)，但植物多酚對雞肉餅的影響不顯著(p>0.05)。經過21 d的貯藏，空白對照組、兒茶素組以及綠原酸組的保水性降至65%左右，而VE組和鼠尾草酸組的保水性較為穩定，維持在80%左右。這可能與鼠尾草酸、VE能有效抑制蛋白氧化、脂肪氧化過程有關。高海燕等的研究表明，VE對保水性的影響可能機制是阻止了雞肉餅冷藏期間的膜磷脂氧化，從而達到保持細胞膜完整性，抑制胞漿液穿過細胞膜發生流失[19]。

圖3 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中保水性的影響Fig.3 Effect of plant polyphonel on water holding capacity of chicken pie during the refrigeration

2.5 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中亞硝酸鹽殘留量及亞硝胺含量的影響

由圖4可以看出，亞硝酸鹽的殘留量隨著冷藏時間的延長呈現先增加后減少的趨勢，但在貯藏后期，多酚組中亞硝酸鹽殘留量明顯高于VE組和空白對照組，這個結果與直接向肉制品中添加植物多酚的結果是恰好相反的。亞硝酸鹽在酸性環境中生成亞硝酐，亞硝酐可與氨基酸和胺類物質生成亞硝胺[2]，這可能是各組樣品中的亞硝酸鹽含量隨著時間延長而下降的一個原因。

圖4 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.4 Effect of plant polyphonel on nitrate residue of chicken pie during the refrigeration

一些研究表明植物多酚對亞硝酸鹽具有清除能力[20]，將植物多酚直接加入肉制品中，如魏延玲等直接將阿魏酸添加到腌制的鱸魚中，研究其在風干及貯藏過程中亞硝酸鹽殘留量的影響，結果發現阿魏酸能降低亞硝酸鹽的殘留量[21]。魏萌將藍莓打漿后加入蒸煮火腿中，發現不同品種、產地的藍莓對亞硝酸鹽的抑制率在6.27%～38.11%[22]。本實驗的結果也可能是由于多酚極性不同，經過雞消化吸收后已經轉變成其他物質或者排出體外，所以對亞硝酸鹽未表現出消除能力，這點還需要進一步探討。

2.6 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中亞硝胺含量影響

本研究共探討了植物多酚對雞肉餅中NDMA和NDEA兩種亞硝胺含量的影響，如表2所示，所有的樣品在第0天均未檢出NDMA和NDEA，而從第7天到第21天，各組樣品中NDMA和NDEA含量均呈明顯增加趨勢，但均未超過國標限定值(3 μg/kg)。當冷藏至第21天時，對照組中NDMA含量明顯高于多酚組(p<0.05)，且兒茶素組NDMA含量最低；與對照組相比較，VE組、綠原酸組、兒茶素組和鼠尾草酸組的NDMA的含量分別下降了10.74%、0.38%、28.34%和6.64%。NDEA組具有與NDMA相同的趨勢，冷藏至21 d時，與對照樣相比，VE組、綠原酸組、兒茶素組和鼠尾草酸組的NDEA含量分別下降了9.36%、18.88%、20.02%和12.94%。

表2 植物多酚對雞肉餅冷藏過程中N-亞硝胺生成量的影響 單位：μg/kg

注： “ND”未檢出。具有不同字母(A～C)表示添加相同得植物多酚的雞肉餅在不同冷藏時間內差異顯著(p<0.05);具有不同的字母(a～e)表示添加不同植物多酚的樣品在相同冷藏時間內差異顯著(p<0.05)。

肉制品中N-亞硝胺的產生和含量受許多因素的影響，包括添加的亞硝酸鹽濃度以及亞硝酸鹽殘留量，N-亞硝胺前體的濃度，貯藏時間等。雞肉餅冷藏過程中NDMA和NDEA的生成可能是因為雞肉餅中蛋白質氧化產生的胺類物質特別是仲胺與亞硝酸鹽生成的亞硝酸酐之間的化學反應[23-24]。雞肉餅中含有約10%的脂肪，它會促進雞肉餅的氧化，也導致雞肉餅在冷藏過程中N-亞硝胺含量增加的一個原因，熊鳳姣等研究發現加工過程中添加肥膘可以顯著增加魚豆腐的NDEA的含量[25]。在多酚組中，兒茶素組的NDMA含量最低，其他多酚組的N-亞硝胺的含量也明顯低于對照組，這說明植物多酚可能是通過抑制N-亞硝胺的前體物質的生成來阻斷N-亞硝胺的生成途經的。YANG等認為蛋白氧化會促進亞硝化作用，導致豬肉背部最長肌在冷藏過程中NDEA含量增加[26]。生物胺也是形成N-亞硝基化合物的重要前體物質，可以參與亞硝化反應，雞肉餅在冷藏過程中因微生物的作用可以生成腐胺、尸胺等化合物，為亞硝胺的生成提供了前體物質。在本研究中，兒茶素具有較強的抑菌能力，鼠尾草酸具有較強的抗氧化能力，而兒茶素比鼠尾草酸表現出更強的對N-亞硝胺的阻斷作用，說明在雞肉餅冷藏過程中，微生物引起的腐敗作用形成的生物胺類物質要多于蛋白氧化生成的胺類物質，促進了N-亞硝胺的生成。此外，兒茶素(極性較強)，鼠尾草酸具有強親脂性(極性較弱)，經過消化系統后所表現出的對肉中N-亞硝胺的抑制作用需進一步探討。

3 結論

在雞的日糧中添加綠原酸、鼠尾草酸以及兒茶素，均可抑制雞肉餅在冷藏過程中的脂肪氧化和蛋白氧化，鼠尾草酸對雞肉餅的TBARS值和蛋白氧化抑制作用較強，但對于保水性的作用不顯著；日糧添加植物多酚并未減少亞硝酸鹽的殘留量，但對雞肉餅中N-亞硝胺的生成有一定的阻斷作用，添加100 mg/kg的鼠尾草酸、綠原酸、兒茶素，可使NDMA生成量下降0.38%、28.34%和6.64%；使NDEA生成量下降18.88%、20.02%和12.94%。因此，在動物日糧中添加綠原酸、兒茶素等植物多酚有助于抑制肉制品的氧化作用，有利于降低肉制品中N-亞硝胺的生成量。此研究對提高我國肉類產品的質量與安全具有一定意義。