響應面法優化超聲波輔助提取杜仲葉茯磚茶綠原酸及其體外降血糖抗氧化活性

曾橋，韋承伯，夏飛，李祥

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安，710021)2(陜西農產品加工技術研究院，陜西 西安，710021) 3(陜西科技大學 化學與化工學院，陜西 西安，710021)

杜仲葉為杜仲科植物杜仲[1](Eucommia ulmoides oliver)的干燥葉，常于夏、秋二季枝葉茂盛時采收，曬干或低溫烘干。《中國藥典》記載其性微辛、溫，歸肝、腎經，具有補肝腎，強筋骨的作用，臨床上常用于治療肝腎不足，頭暈目眩，腰膝酸痛，筋骨痿軟等癥[2]。綠原酸是杜仲葉中的重要活性成分，是評價杜仲葉質量優劣的主要指標[2]，現代藥理研究表明，綠原酸具有抗氧化[3]、抑菌[3-4]、保護心血管[5]、降血糖[6]、降血脂[7]、抗病毒[8]、抗白血病[9]、抗癌[10]等一系列生物活性，在醫藥和食品領域具有廣泛的用途。杜仲葉中綠原酸含量因產地和收獲時間而異，一般可達1%～5%，一些品質較好的杜仲葉，其綠原酸含量和金銀花相當[11]。2018年4月24日國家衛生健康委員會發布《關于征求將黨參等9種物質作為按照傳統既是食品又是中藥材物質管理意見》的函，提出將杜仲葉按照藥食同源物質進行管理，有望在未來進一步拓寬杜仲葉的使用范圍，從而極大地促進杜仲葉資源的開發和利用。

茯磚茶屬于后發酵茶，是近年來茶品市場興起的一個新熱點，由于其內質金花普茂，菌香濃郁，開湯后湯色紅濃，滋味醇和，香氣純正[12]，且具有較好的消食健胃、降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等[13-14]功效，受到消費者的青睞。本文前期以采摘于陜西漢中略陽的杜仲葉為原料，經殺青、揉捻、干燥等制成杜仲葉茶，進一步采用茯磚茶加工工藝制作而成杜仲葉茯磚茶，屬于一種新型茶，目前尚未見杜仲葉茯磚茶功能成分和活性研究的相關報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉茯磚茶：所用杜仲葉為2017年5月采摘于陜西漢中略陽，經陜西科技大學藥學系鑒定為杜仲科植物杜仲的干燥葉，由陜西樸道茯茶股份有限公司加工制成杜仲葉茯磚茶。

乙腈(色譜純),默克股份兩合公司；綠原酸標準品(純度≥98%)、α-胰淀粉酶(13 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(32 U/mg)、阿卡波糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),上海源葉生物科技有限公司；H3PO4、NaCl、FeCl3、乙酸乙酯、淀粉、NaOH、Na2CO3、NaH2PO4、Na2HPO4、鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、抗壞血酸(Vc)、無水乙醇、95%乙醇,天津市天力化學試劑有限公司；HCl、3,5-二硝基水楊酸、4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷,國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸,上海山浦化工有限公司；D101型大孔樹脂,天津允開樹脂科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ThermoU3000高效液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器和Chromeleon 7.10色譜工作站)、Varioskan flash酶標儀,美國Thermo Fisher Scientific公司；TU-1810紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司；FA1004N電子分析天平,上海精密科學儀器有限公司；EX125DZH電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司；RE52CS-1旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠； KH5200DE型醫用數控超聲波清洗器,昆山禾創超聲儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司；TD5A大容量低速離心機,長沙英泰儀器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取杜仲葉茯磚茶1塊(500 g)，粉碎過60目篩，置于50 ℃真空干燥箱中干燥至恒重后，準確稱取杜仲葉茯磚茶粉末2 g，置于一定濃度乙醇溶液中，在一定溫度、液料比、超聲功率下提取一定時間后過濾，濾液定容至100 mL，進一步吸取2 mL定容至50 mL，經0.45 μm微孔膜過濾，得杜仲葉茯磚茶綠原酸供試品溶液。

1.3.2 綠原酸含量測定

1.3.2.1 色譜條件[2]

色譜柱：Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：V(乙腈)∶V(0.4% H3PO4水溶液)=13∶87；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：327 nm。

1.3.2.2 綠原酸標準曲線繪制

精密稱取綠原酸標準品20.922 mg，用體積分數為50%的乙醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，得質量濃度為836.9 μg/mL的綠原酸標準品母液。精密吸取綠原酸標準品母液，分別配制成質量濃度為4.185、8.369、16.738、41.845、83.690 μg/mL的綠原酸標準工作液，采用HPLC法進行測定，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制綠原酸標準曲線。曲線方程為Y=0.531 7X+0.239 6，R2=0.999 9，線性關系良好。

1.3.2.3 供試品溶液綠原酸含量測定

取供試品溶液，采用HPLC法按1.3.2.1項下色譜條件進行測定，計算峰面積，依綠原酸標準曲線計算綠原酸含量。

1.3.2.4 綠原酸得率計算

(1)

式中：Y為綠原酸質量濃度，μg/mL；V為供試品溶液體積，mL；D為稀釋倍數；B為原料質量，g；106為質量換算系數。

1.3.3 單因素實驗

準確稱取杜仲葉茯磚茶試樣2 g置于100 mL錐形瓶中，在液料比25∶1(mL∶g)、提取時間30 min、提取溫度60 ℃、超聲功率60 W條件下，考察乙醇體積分數分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%對綠原酸得率的影響；在乙醇體積分數為50%、提取時間30 min、提取溫度60 ℃、超聲功率60 W條件下，考察不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL∶g)對綠原酸得率的影響；在乙醇體積分數為50%、 液料比25∶1(mL∶g)、提取溫度60 ℃、超聲功率60 W條件下，考察提取時間分別為10、20、30、40、50、60、70 min對綠原酸得率的影響；在乙醇體積分數為50%、液料比25∶1(mL∶g)、提取時間30 min、超聲功率60 W條件下，考察提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃對綠原酸得率的影響；在乙醇濃度為50%、液料比25∶1(mL∶g)、提取時間30 min、提取溫度60 ℃條件下，考察超聲功率分別為40、50、60、70、80、90、100 W對綠原酸得率的影響。

1.3.4 響應面優化杜仲葉茯磚茶綠原酸提取工藝

在單因素實驗基礎上，固定超聲功率為90 W，選取乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取溫度等4個因素，利用Design Expert 8.0.6軟件，設計4因素3水平Box-Behnken中心組合實驗，響應面因素及水平設計見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 杜仲葉茯磚茶綠原酸的純化[15]

將D101大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h后，去離子水洗至無醇味，進一步用體積分數5% HCl溶液提取12 h，去離子水洗至中性；然后用質量濃度為50 g/L 的NaOH溶液提取12 h，去離子水洗至中性；最后用體積分數為95%乙醇洗滌，水洗至中性后備用。將預處理后的D101大孔樹脂濕法裝入離子交換柱，將在最優提取工藝條件下提取的綠原酸提取液離心(4 000 r/min)15 min，取上清液，用濃HCl調至pH=2，自離子交換柱上端倒入柱中，進行動態分離，調節去離子水為pH=2，沖洗3～5 BV(樹脂體積)洗脫以去除雜質，用體積分數為30%乙醇洗脫綠原酸。上樣、洗柱、洗脫速度均為2 BV/h。

將洗脫所得綠原酸溶液55 ℃減壓濃縮至質量濃度約為40 mg /mL，采用乙酸乙酯按酯相和水相為1∶1萃取5次，每次萃取20 min，合并萃取液旋轉蒸發濃縮至干，采用去離子水復溶，冷凍干燥得純化后的綠原酸，經HPLC檢測，綠原酸純度為30.31%。

1.3.6 降血糖作用研究

1.3.6.1 ɑ-胰淀粉酶抑制活性的測定[16]

稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，溶于NaCl濃度為6 mmol/L的20 mmol/L pH 6.9的磷酸鈉緩沖液，配制成質量濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的綠原酸溶液。于各試管中分別加入上述不同質量濃度的綠原酸溶液200 μL與200 μL α-淀粉酶溶液(1.0 U/mL，溶于pH 6.9的磷酸鈉緩沖液)混合，記為樣品；以緩沖液代替酶溶液記為背景；用含NaCl的緩沖液代替樣品溶液記為陰性對照。所有試管溶液于37 ℃水浴孵育10 min后加入400 μL 2.5 g/L的淀粉溶液，置于37 ℃水浴中反應10 min后加入1.0 mL DNS顯色劑(1% 3,5-二硝基水楊酸、12%酒石酸鉀鈉共同溶于0.4 mol/L NaOH)終止反應，沸水浴10 min 后冷卻至室溫，加入10 mL蒸餾水稀釋，以緩沖液調零，于540 nm波長處測定樣品、背景、陰性對照的吸光度值，分別記為A樣品、A背景和A陰性。以阿卡波糖為陽性對照，按下式計算樣品對α-胰淀粉酶的抑制率：

(2)

1.3.6.2 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制活性的測定[16-17]

稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，溶于40%乙醇溶液，配制成質量濃度分別為0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL的溶液，在96孔板中，分別加入20 μL的綠原酸溶液與40 μL 5 mmol/L的4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷溶液(溶于pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液)，在37 ℃下孵育5 min后，分別加入10 μL 1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液(溶于pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液)，振蕩均勻，37 ℃下反應10 min后加入140 μL 0.2 mmol/L的Na2CO3溶液終止反應，得待測樣品。同時以緩沖液代替酶溶液，以40%乙醇溶液代替綠原酸溶液，其余操作條件同樣品，分別記為背景和空白對照。于400 nm波長處測定樣品、背景、空白對照的OD值，分別記為A樣品、A背景和A空白。以阿卡波糖為陽性對照，用以下公式計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率：

(3)

1.3.7 抗氧化活性研究

1.3.7.1 DPPH自由基清除活性測定[18]

稱取一定量DPPH粉末，用無水乙醇配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液。稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，分別配制質量濃度為4、8、12、16、20、24 μg/mL的溶液。取6支潔凈具塞試管，分別依次加入DPPH溶液2 mL，各濃度梯度杜仲葉茯磚茶綠原酸溶液2 mL，混勻后室溫放置30 min，以蒸餾水調零，于517 nm處測吸光度記為A樣品。用蒸餾水代替DPPH溶液按上述方法處理測定吸光度記為A對照，以蒸餾水代替杜仲葉茯磚茶綠原酸提取液按上述方法處理測定吸光度記為A空白。同時，以VC為陽性對照。按下式計算DPPH自由基清除率：

(4)

1.3.7.2 鐵還原力測定[19]

稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，分別配制質量濃度為0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL的溶液，分別取各梯度濃度綠原酸溶液0.5 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液、5 mL蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min，以無水乙醇代替綠原酸提取液按上述處理作空白對照，于700 nm波長處測定吸光度。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次，響應面優化實驗數據采用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次回歸分析及方差分析，其余實驗結果均采用Graph Pad Prism軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖1可知，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率隨乙醇體積分數的變化先增大后減小，當乙醇體積分數為40%時，綠原酸得率達到最大值，繼續增大乙醇體積分數，綠原酸得率則開始下降，當乙醇體積分數大于60%時，下降最為明顯。雖然增大乙醇體積分數有利于綠原酸的溶出，但過大，易造成雜質的溶出，削弱綠原酸的溶出，從而導致綠原酸提取率下降[20]。因此，適宜的乙醇體積分數為40%。

圖1 乙醇體積分數對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fubrick tea

2.1.2 液料比對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖2可知，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率先隨液料比增加而增大，當液料比達到25∶1 (mL∶g)時，綠原酸得率達到最大值2.376 2%，繼續增大液料比，綠原酸得率則開始下降。這是由于液料比的增加有利于增大綠原酸的絕對溶出量，但是過大的液料比也會造成雜質的溶出和能耗的增大。因此，適宜的液料比為25∶1 (mL∶g)。

圖2 液料比對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.2 The effect of liquid-solid ratio on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.1.3 提取時間對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率也逐步增大，當提取時間為50 min時，得率達到最大2.388 9%，繼續延長時間，得率緩慢下降。由于過長的提取時間可能導致綠原酸的結構遭到破壞[21]以及雜質的溶出。因此，適宜的提取時間為50 min。

圖3 提取時間對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.1.4 提取溫度對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率增加較為顯著，當溫度為60 ℃時，綠原酸得率達到最大2.216 2%，繼續升高溫度，綠原酸得率又開始下降。這可能是由于溫度升高，分子運動加快，促進了綠原酸的溶出，但是過高的溫度可能會破壞綠原酸的結構，從而導致得率下降。因此，適宜的提取溫度為60 ℃。

圖4 提取溫度對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.1.5 超聲功率對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

從圖5可以看出，當超聲功率較低時，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率變化不大，當功率超過80 W時，綠原酸得率顯著增加，當功率為90 W時，綠原酸得率達到最大2.281 0%，繼續增大超聲功率，得率則開始下降。因此，適宜的超聲功率為90 W。

圖5 超聲功率對杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.2 杜仲葉茯磚茶綠原酸提取工藝的響應面優化

在單因素實驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，確定以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)為基礎設計4因素3水平共29組響應面分析實驗。實驗因素和水平設計見表1，實驗方案設計及結果見表2，方差分析見表3，各響應面分析圖見圖6。

由響應面分析結果對各因素擬合所得回歸方程為：Y=-5.308 62+0.055 567A+0.220 02B+6.075 40× 10-3C+0.128 40D+1.528 13×10-4AB-3.275 00×10-5AC-2.497 50×10-4AD-3.052 50×10-4BC+1.625 00×10-3BD+3.353 75×10-4×CD-5.494 51×10-4A2-6.252 81×10-3B2-1.754 75×10-4C2-1.452 65×10-3D2

表2 Box-Behnken中心組合實驗設計及結果Table2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 回歸方程方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression equation

注：***：差異極顯著(p<0.001)；**：差異高度顯著(p<0.01)；*：差異顯著(p<0.05)。

圖6 各因素交互作用對綠原酸得率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots showing the interactive effectsof various factors on chlorogenic acid extraction rate

由圖6可知，提取溫度，液料比以及乙醇濃度對綠原酸的得率均有較顯著的影響。其中，液料比對綠原酸得率的影響最為顯著，隨著液料比的增大，綠原酸得率先增大后減小，提取溫度對綠原酸得率影響相對顯著，乙醇體積分數次之，提取時間影響最小，曲面較為平緩[21]。這與表3回歸分析結果相符。

經模型預測，杜仲葉茯磚茶綠原酸最佳提取條件為超聲功率90 W，乙醇體積分數38.77%，提取時間49.96 min，液料比24.70∶1 (mL∶g)，提取溫度60.45 ℃，在該最佳條件下，杜仲葉茯磚茶多糖得率為2.518 7%。考慮到實際操作過程的簡便，對各個工藝參數稍作修改為：超聲功率90 W，乙醇體積分數39%，提取時間50 min，液料比25∶1 (mL∶g)，提取溫度60 ℃，經過3次平行驗證實驗，在此條件下，綠原酸得率為2.446 1%，與預測值相對誤差為2.88%，說明該提取工藝條件準確可行，具有應用價值。

2.3 杜仲葉茯磚茶綠原酸體外降血糖抗氧化活性

2.3.1 體外降血糖作用研究

2.3.1.1 對α-胰淀粉酶的抑制活性

由圖7可以看出，杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-胰淀粉酶有較強的抑制作用，但抑制能力較阿卡波糖要低。隨著綠原酸濃度的增大，抑制率也逐步增加，當綠原酸濃度達到1.4 mg/mL時，其對α-胰淀粉酶的抑制率達到83.26%，相同濃度下阿卡波糖對α-胰淀粉酶的抑制率為97.14%。在0.4～1.4 mg/mL范圍內，綠原酸質量濃度與抑制率間存在線性正相關，擬合方程為：Y=0.487 4X+0.162 1，R2=0.994 8，線性關系良好。通過該擬合方程可計算出杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-胰淀粉酶半抑制濃度(IC50)為0.69 mg/mL。

圖7 杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-胰淀粉酶抑制活性Fig.7 α-pancreatic amylase inhibitory activity of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations

2.3.1.2 對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖8可以看出，杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用，但抑制能力較阿卡波糖要低。隨著綠原酸質量濃度的增大，抑制率也逐步增加，當綠原酸質量濃度達到0.18 mg/mL時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到96.80%，與相同濃度下阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率相當。從圖8還可以發現杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-葡萄糖苷酶的IC50為0.08～0.10 mg/mL。

圖8 不同質量濃度杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.8 α-glucosidase inhibitory activity of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations

2.3.2 體外抗氧化活性研究

2.3.2.1 DPPH自由基清除作用

從圖9可以看出，杜仲葉茯磚茶綠原酸具有較好的DPPH自由基清除作用，其清除能力優于Vc，其對DPPH自由基的清除效果隨質量濃度的增大而增大，當綠原酸濃度達12 μg/ mL時，其對DPPH自由基的清除率為91.84%，繼續增大綠原酸質量濃度，清除率增加緩慢。當綠原酸質量濃度達24 μg/ mL時，其對DPPH自由基的清除率可達97.94%。

圖9 不同質量濃度杜仲葉茯磚茶綠原酸對DPPH自由基清除作用Fig.9 Scavenging activity of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations against DPPH free radicals

2.3.2.2 還原力測定

由圖10可以看出，當質量濃度低于0.16 mg/mL時，杜仲葉茯磚茶綠原酸的還原力隨著質量濃度的增大而顯著增大，當質量濃度高于0.16 mg/mL時，其還原力增加稍有變緩。此外，由圖10可以看出，綠原酸的還原力明顯優于Vc。

圖10 不同質量濃度杜仲葉茯磚茶綠原酸還原力Fig.10 Ferric reducing power of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations

3 結論

本實驗所用杜仲葉茯磚茶以杜仲葉茶為原料，采用茯磚茶加工工藝制作而成，具有普通茯磚茶金花普茂，菌香濃郁，開湯后湯色紅濃，滋味醇和，香氣純正等特征，品質較杜仲葉茶大大提高。綠原酸是杜仲葉重要活性成分之一，杜仲葉茯磚茶綠原酸的提取工藝研究結果表明，最佳提取條件為：超聲功率90 W，乙醇體積分數39%，提取時間50 min，液料比25∶1 (mL∶g)，提取溫度60 ℃，該條件下綠原酸得率為2.446 1%。降血糖實驗結果表明，杜仲葉茯磚茶綠原酸對α-胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性均有一定的抑制作用，因此，經常飲用杜仲葉茯磚茶可以起到降低餐后血糖和糖化血紅蛋白水平、減低血糖值波動、防治糖尿病有關并發癥的作用。此外，杜仲葉茯磚茶綠原酸還具有較強的抗氧化活性，其對DPPH自由基的清除作用以及鐵還原力均高于Vc。