超高效液相色譜串聯質譜法同時測定飲料中γ-羥基丁酸及其前體物質

龔蕾，韓智，劉杰，朱曉玲，王會霞，彭青枝

(湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北 武漢，430075)

γ-羥基丁酸(GHB)具有強烈的鎮靜作用和健忘效果，并且無色無味，其鈉鹽穩定存在，很容易加入到飲料中而不被發覺；同時，GHB也能刺激人體分泌荷爾蒙素，增加快感，因此GHB往往又與性犯罪聯系在一起，在娛樂場所被濫用，帶來了嚴重的社會問題[1]。歐美很多國家已經將GHB列為一類藥品管制，我國于2001年5月將GHB列為二類精神藥物進行管理，2007年我國將其列入一類精神藥物進行管制[2]。但是由于原料易得和合成簡單，其違法使用情況依然存在，此現象引起了人們的廣泛重視。γ-丁內酯(GBL)作為一種食品添加劑可用于食品合成香料領域，1,4-丁二醇(1,4-BD)可作為食品接觸材料添加劑運用于包裝材料中。然而，GBL在酶催化作用下或提高pH情況下，可以很快轉化為GHB；1,4-BD在人體中也很快代謝為GHB，3種物質的結構式見圖1。

目前并沒有同時檢測食品中GHB、1,4-BD及GBL的國家標準，只有一個公共安全行業標準GA/T 1074—2013《生物樣品中γ-羥基丁酸的氣相色譜-質譜和液相色譜-串聯質譜檢驗方法》[3]，但該標準的檢測對象為生物樣品(尿液、血液、組織和毛發)，檢測物質僅是GHB。據文獻報道，GHB的分析方法主要有氣質聯用法(GC-MS)[4-6]、液質聯用法(LC-MS)[4, 7-10]和毛細管電泳法(CE)[11]等。氣相色譜法(GC)應用較少，主要是由于GHB分子量小，且含有一個羥基和一個羧基兩個強極性基團，熱穩定性不好。與GC相比，GC-MS應用較為廣泛，但是一般也需要衍生化處理或將GHB轉化為GBL，因此也只能檢測一種物質。WOOD等[12]以C18為固定相，以甲醇-0.1%(體積分數)甲酸水溶液為流動相，對尿液中的GHB、GBL、1,4-BD進行了分析，檢出限為1 mg/L。張浩杰[13]將飲料用濾膜過濾后，用T-3色譜柱分離，以甲醇-水為流動相梯度洗脫，串聯質譜MRM模式檢測，5 min內實現有效分離。施妍等[14]利用HPLC-MS/MS測定尿液中的GHB、1,4-BD和GBL，檢出限分別為0.1、0.1和2μg/mL，準確度為87.6%～98.1%。

圖1 GHB(a), GBL(b)和1,4-BD(c)的化學結構Fig.1 Chemical structures of GHB, GBL and 1,4-BD

目前，針對生物樣品例如尿液血液中的GHB含量檢測已經有相關文獻報道[5-10]。然而，由于GBL和1,4-BD在人體中都可以很快代謝成GHB，并且GHB自身在體內也會很快代謝，導致生物樣品中GHB及其相關物質的檢測具有較強的時效性，從而給實際案件的鑒定和確證工作帶來了很大的不確定性。而且，GHB內源性的天然物質，國際毒理學會建議人體尿樣中GHB的臨界值(cut-off值)為10 μg/mL，這給實際尿樣陽性結果的判斷帶來一定困難。GHB，GBL和1,4-BD經常被犯罪分子故意添加到飲料中進行犯罪活動，而三者在飲料中不會發生代謝，穩定性較高，因此有必要建立飲料中GHB，GBL和1,4-BD的含量檢測方法，為GHB及其前體物質的合法性提供數據。本文建立了飲料中GHB，GBL和1,4-BD同時檢測的UPLC-MS/MS分析方法，此方法快速準確，是一種方便且可靠的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Water Xevo-TQD三重四級桿質譜儀，美國Waters公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；P型移液器，德國Brand公司；離心機，美國Beckman Coulter公司；0.22 μm濾膜，天津津騰實驗設備有限公司。

γ-羥基丁酸鈉(純度≥98.0%)，美國MedChemExpress公司；γ-丁內酯(純度≥99.9%)，北京壇墨質檢科技有限公司；1,4-丁二醇(純度≥99.6%)，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙酸銨、甲酸(色譜純)，美國Fisher公司；乙腈、甲醇(色譜純)，德國Merck KgaA公司；飲料樣品購置于網絡平臺或市售，包括固體飲料(按照產品推薦的沖調倍數稀釋)。

GHB、1,4-BD、GBL單標溶液：分別稱取100 mg標準品于100 mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容到刻度，配制成1 mg/mL的單標溶液，備用。

GHB、1,4-BD、GBL基質標準溶液：分別稱取一定體積GHB、1,4-BD、GBL單標溶液于10 mL容量瓶中，用稀釋了25倍的空白樣品提取液定容到刻度，配制成0.5、1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的基質標準溶液，備用。

1.2 UPLC-MS/MS條件

1.2.1 UPLC條件

Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm，3.0 μm)色譜柱；流動相：A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序見表1；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正負離子模式同時掃描；毛細管電壓：2 000 V；源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；錐孔氣流量：30 L/h；采集模式：多反應監測(MRM)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 不含蛋白飲料

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，經微孔濾膜過濾，取續濾液，根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內，供UPLC-MS/MS測定。

1.3.2 含蛋白飲料

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)于25 mL容量瓶中，加入2 mL甲醇，搖勻，以沉淀蛋白質，再加水定容至刻度，混勻，轉移至離心管中于4 500 r/min下離心15 min，取上清液，經微孔濾膜過濾，取續濾液，根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內，供UPLC-MS/MS測定。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

采用蠕動泵分別將質量濃度為10 μg/mL的GHB、1,4-BD、GBL單標溶液注入離子源，以便于對質譜分析條件進行優化。在全掃描方式下分別對3種化合物進行一級質譜分析，發現1,4-BD和GBL在正離子模式下響應較高，GHB在正離子和負離子模式下均有響應，但據后續試驗發現，同時測定3種化合物需要采用正負離子同時掃描。本實驗GHB采用負離子掃描模式，1,4-BD和GBL采用正離子掃描模式，并在各自對應的模式下得到各自的分子離子峰，通過優化錐孔電壓使各分子離子峰達到最大響應值；再分別對分子離子進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到相應的碎片離子，并通過優化碰撞能量使碎片離子達到最大響應值。得到最佳質譜條件見表2。

表2 三種化合物的定性離子、定量離子、錐孔電壓 和碰撞能量Table 2 Qualitative ion, quantitative ion, cone voltage and collision energy of three compounds

注：a-定量離子；b-定性離子

2.2 源參數優化

圖1展示了GHB和GBL的化學結構式，GBL是由GHB脫去1分子水縮合而成的環狀化合物。有國外文獻報道了GHB和GBL在源內的相互轉化[7, 9]，即“源內裂解”，而已有的國內文獻則并未提及。源內裂解主要是指由于離子化過程較為劇烈，使得生成的離子具有足夠的內能發生進一步裂解，如失H2O、失糖苷等，生成的基團(子離子)與某種物質的結構一樣而被作為“母離子”繼續被裂解。源內裂解的過程與四級桿MS/MS的裂解過程十分相似，后者主要是使用一個相對較低的碰撞能量來產生碎片，其觀察到的碎片離子依賴于碰撞能量的大小，而源內裂解的過程主要依賴于源區的接口電壓的大小，一般而言，源內裂解只能減少而不能消除。在本試驗中也觀察到了源內裂解現象，因此，降低源內裂解程度是本試驗所關注的重點。研究表明，降低源溫度及噴霧電壓能有效減少源內裂解程度，但同時會降低離子豐度。本試驗綜合考慮得出最佳條件為：源溫度120 ℃，噴霧電壓2 000 V，脫溶劑溫度300 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h。

GHB在ESI+模式下失水產生87.0的碎片離子，此碎片離子的質量數與GBL在ESI+模式下的一級母離子質量數一致；GBL則容易加水產生105.0的離子，此離子與GHB在ESI+模式下的一級母離子質量數一致，若同時采用ESI+模式掃描，則不能從色譜圖區分2種化合物，見圖2-e與圖2-f。因此，GHB采取ESI-模式掃描，GBL與1,4-BD采用ESI+模式掃描，能從色譜圖上區分開來。由2-a為GHB的單標標準溶液進樣后得到的總離子流圖(TIC)，圖2-b為GBL的單標標準溶液進樣后得到的總離子流圖，從圖2-a中可以看出GHB單標標準溶液色譜圖中，在相同保留時間(3.13 min)的地方也出現了GBL的峰，圖2-b中GBL的單標標準溶液的色譜圖中顯示GBL的出峰時間為3.70 min，此結果顯示GHB易發生源內裂解，與JOHANSEN[7](圖2-c)和S?RENSEN[9](圖2-d)的研究結果一致。因此，建議采取合適的洗脫梯度將GBL與GHB完全分離。

a-GHB單標TIC圖；b-GBL單標TIC圖；c-JOHANSEN研究結果；d-S?RENSEN研究結果；e-ESI+模式下GHB的TIC圖；f-ESI+模式下的GBL的TIC圖圖2 源內裂解相關色譜圖Fig.2 Some chromatograms of in-source collision-induced dissociation

2.3 三種物質的定量分析方法考察

2.3.1 色譜柱的選擇

本研究中的3種目標化合物中，GHB為極性化合物，1,4-BD為弱極性化合物，GBL為非極性化合物，因此，在選擇色譜柱時，應兼顧保留極性化合物同時對中等極性和非極性化合物也應有所保留。本研究比較考察Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)、Waters Atlantis T3(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)、Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)三種實驗室常用的色譜柱，結果表明，GHB、1,4-BD在前兩種色譜柱上保留較差，而Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)色譜柱對GHB、1,4-BD有保留，峰型較好(圖3)。因此，本研究初步選擇 Thermo Gold C18(150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)色譜柱開展后續實驗。

圖3 GHB、1,4-BD和GBL總離子流圖Fig.3 Total lon chromatograms of GHB, 1,4-BD and GBL

2.3.2 流動相的選擇

液相使用的流動相為乙腈和2 mmol/L乙酸銨溶液。前期比較考察了乙腈-水(圖4-a)、乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液(圖4-b)、甲醇-水(圖4-c)和甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(圖4-d)4個流動相體系，實驗結果表明，當采用乙腈時，所得到的色譜峰峰型較尖銳，因此選擇乙腈作為流動相體系之一；當采用水作為流動相時，GHB出峰時間延后，但其色譜峰較寬，峰形較差，將水相中加入甲酸或乙酸銨后，其色譜峰峰形明顯改善。另外，鑒于本實驗質譜部分所采用的掃描模式為正負離子同時掃描，所以選擇低濃度的乙酸銨溶液作為流動相可有效避免甲酸對負離子掃描的抑制作用，同時避免高濃度的鹽可能會造成的離子競爭抑制。因此，最終選擇以乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

2.3.3 基質效應

UPLC-MS/MS是水溶液中藥物殘留的首選檢測方式之一，但是這種檢測方式的一個主要缺點是具有基質效應(matrixeffects，ME)。一般來說，當ME在80%～120%時，表明基質效應在可接受范圍內，在實際檢測中可以忽略基質效應。本研究比較了樣品直接過膜上機和將樣品進行一定倍數的稀釋后再上機檢測兩種處理方法，并比較了不同稀釋倍數對檢測結果的影響。

參照張浩杰等[13]對飲料的處理方式以及后期優化前處理條件進行處理分析，表3為樣品的加標回收率。可以看出，直接過膜上機對GHB和1,4-BD的回收率較低，不滿足實驗要求，同時也表明，飲料基質對GHB和1,4-BD的檢測存在較強的基質干擾。

a-乙腈-水;b-乙腈-2 mmol/L乙酸銨;c-甲醇-水;d-甲醇-2 mmol/L乙酸銨圖4 不同流動相的影響Fig.4 The effects of different flow phases

表3 GHB、1,4-BD、GBL回收率(直接過膜上機) 單位：%

基質效應的消除可采取配制基質標準曲線或對樣品進行其他前處理凈化等方式解決。鑒于GHB、1,4-BD和GBL的極性差異較大，分別為極性、弱極性、非極性化合物，因此，較難選擇合適的固相萃取小柱進行凈化處理。同時，γ-丁內酯在前處理過程中可隨水蒸氣揮發，因此，對于碳酸飲料和含酒精的飲料也不適合采用加熱除二氧化碳或除酒精后復溶的處理過程。考慮到飲料中若非法添加GHB、1,4-BD、GBL，根據不法分子的添加動機分析，其添加量不可能很低(因為GHB在人體中本身就內源性存在，添加量太少，對人體不起作用)，所以本研究最終選擇直接稀釋的方法進行樣品處理以消除基質效應。

本實驗將樣品分別稀釋5倍、10倍、25倍及50倍進行加標回收，結果表明(圖5)，隨著稀釋倍數增加，GHB的基質效應顯著降低，但依然不高于50%；當稀釋倍數達到25時，1,4-BD和GBL回收率均超過90%，基質效應可基本忽略。因此，在實際樣品檢測時，建議考慮按照1.1配制基質標準曲線，以消除不同基質對質譜中GHB響應信號的影響。考慮到方法檢出限、儀器響應等情況，最終將稀釋倍數定為25倍。

圖5 不同稀釋倍數下GHB(a)、1,4-BD(b)、GBL(c)加標回收率%Fig.5 The recovery of GHB(a), 1, 4-BD(b) and GBL(c) of different dilution multiple

2.3.4 線性關系和檢出限

配制一系列質量濃度的標準溶液在2.2的儀器分析條件下進行測定，得出3種物質在0.5～10.0 μg/mL呈現出良好的線性關系，相關系數r均大于0.99，檢出限(RSN=3)均為0.5 μg/mL。3種化合物的標準曲線、線性范圍和相關系數見表4。

表4 GHB、1,4-BD、GBL的線性范圍、校準曲線 方程和相關系數Table 4 Linear range, calibration curve equation and correlation coefficient of GHB, 1, 4-BD and GBL

2.3.5 精密度、重復性和穩定性

準確吸取標準品溶液，按2.2的儀器條件進樣，連續進樣6次，測定各自的峰面積，以峰面積為對象，計算相對標準偏差(RSD)。計算得標準品峰面積RSD小于0.10%，保留時間RSD小于1.0%，表明該方法精密度良好。

平行制備同一濃度混合標準品6份，按2.2的儀器條件進樣，以標準品的峰面積和保留時間為對象，得出RSD值均小于1.5%，表明該測定方法的重復性良好。

準確吸取質量濃度為10 μg/mL的標準品溶液，在1.2的儀器條件下，分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48 h進樣，以標準品的峰面積和保留時間為對象，得出RSD<2.0%，表明標準品溶液在48 h內穩定，儀器穩定性良好。

2.3.6 回收率

稱取同一樣品各3份，分別對樣品進行3個水平的加標回收率實驗，每個實驗均6次重復，以不加混合標準品溶液的樣品作參照，并按照2.3方法制備供試品溶液，按2.2的儀器條件進樣，根據測定的含量，計算其相應的回收率，結果見表5。不含蛋白飲料GHB的回收率為81.1%～87.7%，RSD為3.8%～5.7%(n=6)，1,4-BD的回收率為98.5%～99.6%，RSD為4.4%～5.3%(n=6)，GBL的回收率為107.5%～113.6%，RSD為3.9%～5.1%(n=6)；含蛋白質飲料GHB的回收率為82.6%～82.8%，RSD為3.3%～5.2%(n=6)，1,4-BD的回收率為98.7%～99.8%，RSD為3.7%～4.4%(n=6)，GBL的回收率為110.5%～116.2%，RSD為3.5%～4.6%(n=6)。結果表明上述實驗方法準確度較高，能應用于飲料中GHB、1,4-BD和GBL的檢測分析。

表5 GHB、1,4-BD、GBL的回收率(n=6)Table 5 The recovery of GHB, 1, 4-BD and GBL(n=6)

2.4 實際樣品檢測

采用所建立的方法對市售和網上購買的樣品(共40批次)進行了檢測，結果如表6。

3 結論

本研究建立了飲料中GHB及其前體物質1,4-BD和GBL的HPLC-MS/MS方法，其檢出限為0.5 μg/mL，該方法靈敏度高、簡便快速，可靠性高。應用此方法，本研究檢測了40份樣品中GHB、GBL和1,4-BD的含量水平，檢驗結果均為未檢出。本研究所建立的分析方法及研究結果能為實際檢測提供技術支持和數據支撐。

表6 市售和網購各類飲料中GHB、1,4-BD和GBL的測試結果Table 6 The result of GHB, 1, 4-BD and GBL in actual beverage samples

注：ND代表未檢出。