抑制嘔吐毒素生物合成的乳酸菌的篩選及鑒定

羅煒，宋春艷，李彥林，張蔚，魯心怡，曹鈺*

1(江南大學，教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

鐮刀菌是谷物感染赤霉病的主要病原菌，其在適宜環境下通過侵染麥子穗部從而導致作物死亡，對農業造成巨大的經濟損失[1]。此外，鐮刀菌還會產生各種真菌毒素，包括玉米赤霉烯酮、伏馬毒素，以及多種單端孢霉烯族毒素等[2]，其中單端孢霉烯B族化合物嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)由于其易溶于水，對各類以谷物為主要原料的食品行業影響巨大，尤其是在啤酒中的大量堆積，會對人體安全產生重大威脅[3]。

為了保障食品安全性，降低谷物污染程度，可以通過抑制產毒真菌生長來實現[4]。目前一般采用化學殺菌劑來達到抑制產毒真菌生長，減少毒素產生的作用，但化學試劑可能對人體和環境產生一定危害[5]，利用生物殺菌劑代替化學殺菌劑符合人們安全和環保需求。其中乳酸菌作為生物殺菌劑的典型代表，很早就用于食品防腐殺菌方面，通常乳酸菌都被認為是安全的菌株[6]，其產生的代謝產物，包括有機酸[7-8]、蛋白類物質[9-10]等證明能夠抑制產毒真菌特別是鐮刀菌生長[11]，進而降低谷物中DON的產生。研究顯示啤酒生產中DON主要由鐮刀菌在制麥過程中產生，通過在浸麥開始添加乳酸菌菌液，能夠最終降低麥芽中DON質量濃度[12]，說明利用乳酸菌降低谷物食品中DON質量濃度是可行的。

本實驗通過篩選能夠抑制禾谷鐮刀菌生長的乳酸菌，并研究其對禾谷鐮刀菌DON生物合成的影響，以期為利用乳酸菌降低谷物食品鐮刀菌污染方面提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)ACCC36938，購自中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

MRS培養基；PDA培養基；KMnO4-KBr-MRS培養基[13]：在MRS培養基中加入質量濃度2 g/L KMnO4和質量濃度2.5 g/L的KBr；綠豆湯培養基[14]：質量濃度30 g/L綠豆加入蒸餾水中煮沸3 min，過濾定容即可。

1.1.3 試劑和儀器

DON試劑盒購自青島普瑞邦生物公司；API50CHL試劑盒購自梅里埃公司；DNA提取試劑盒購自上海生工公司；蛋白酶購自江蘇銳陽公司；其他試劑購自國藥集團。

酶標儀Enspire2300，珀金埃爾默有限公司；BME顯微鏡，上海徠卡公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌篩選

將土壤、酸菜等發酵食品樣品加入到滅菌的MRS液體培養基中于30 ℃下振蕩培養12 h，取其中100 μL液體稀釋凃布到含KMnO4-KBr-MRS培養基上，在30 ℃培養箱中培養48 h，選擇透明圈較大的單菌落挑起接種到新的MRS平板上純化2次，然后進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，將革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶試驗陰性且能在KMnO4-KBr-MRS平板上產生較大透明圈的菌株初步認定為乳酸菌，甘油管保藏。

1.2.2 乳酸菌對禾谷鐮刀菌抑制作用

1.2.2.1 禾谷鐮刀菌孢子制備

將禾谷鐮刀菌接種到PDA培養基上， 25 ℃下培養3 d，然后取部分菌絲接種到綠豆湯培養基中，在200 r/min，25 ℃搖床中振蕩培養3～5 d至產生大量孢子，血球板計數，用無菌水稀釋至105個孢子/mL濃度，備用。

1.2.2.2 抑菌實驗

將篩選得到的乳酸菌菌株接種到MRS液體培養基中，在30 ℃下靜置培養24 h，用生理鹽水將其稀釋至濃度為1×109CFU/mL，然后取20 μL乳酸菌菌液點接在MRS平板中心，將其在30 ℃下靜置培養2 d，覆蓋上50 ℃左右每毫升含104個禾谷鐮刀菌孢子的PDA培養基，凝固后在30 ℃下培養3 d，測量抑菌直徑，以不加乳酸菌的相同濃度的禾谷鐮刀菌孢子培養物做對照。

1.2.3 乳酸菌培養物中抑菌物質特性分析

1.2.3.1 乳酸菌上清液的制備

將活化乳酸菌按5%接入MRS培養基中，30 ℃培養2 d，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.2.3.2 熱處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

將乳酸菌上清液分別在60、80、100 ℃下處理10 min，然后按1∶9加入到50 ℃左右的PDA培養基中，混勻倒平板，待其凝固后在平板中心滴加20 μL禾谷鐮刀菌孢子液，30 ℃培養3 d，測定禾谷鐮刀菌生長直徑，以無菌水代替上清液做對照，計算各上清液的抑菌率。

抑菌率/%=

1.2.3.3 酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

調節乳酸菌上清液的pH值到酸性蛋白酶、中性蛋白酶的胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫酶的最適pH值，按1 mg/mL加入相應酶到乳酸菌上清液中，分別在其最適溫度下水浴2 h，處理結束調回原pH值，然后按1∶9加入到50 ℃左右的PDA培養基中，混勻倒平板，待其凝固后在平板中心滴加20 μL禾谷鐮刀菌孢子液，30 ℃培養3 d，觀察禾谷鐮刀菌生長直徑，以無菌水代替上清液做對照，計算各上清液的抑菌率(同1.2.3.2)。

1.2.3.4 pH值處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

采用牛津杯法，將乳酸菌上清液濃縮10倍，分別調pH值至5.0、6.0，取200 μL禾谷鐮刀菌孢子液涂布到PDA平板上，放置牛津杯，加入200 μL不同pH值的濃縮上清液，以原上清液做對照，30 ℃下培養2 d，記錄抑菌直徑。

1.2.4 乳酸菌在麥芽汁培養基中生長情況

1.2.4.1 麥芽汁培養基制備

按圖1糖化工藝曲線配制麥芽汁培養基，麥芽粉碎度為2，料水比為1∶4，初始按1800 U/g大麥加入中性蛋白酶，糖化結束后煮沸1 h，濾紙過濾，稀釋成8%糖濃度，加入質量濃度10 g/L檸檬酸氫二銨，115 ℃下滅菌20 min。

圖1 麥芽汁制備的糖化工藝曲線Fig.1 Profile of mashing process for wort preparation

1.2.4.2 乳酸菌在麥芽汁培養基中生理特性研究

將活化乳酸菌菌株按10%接種量接入麥芽汁培養基中，在30 ℃下靜置培養，每隔3 h取樣測600 nm下吸光值，以空白培養基做對照，同時測定樣品總酸，繪制生長曲線和產酸曲線，每組3個平行。

1.2.5 乳酸菌對禾谷鐮刀菌生長及DON生物合成的影響

將活化乳酸菌接種到麥芽汁培養基中，在30 ℃下培養18 h，然后各取1、5 、10 、20 mL乳酸菌菌液離心菌體細胞，與4 mL濃度為1×105個孢子/mL的禾谷鐮刀菌菌液混合倒入滅菌培養皿中，再加入50 ℃左右的麥芽汁瓊脂培養基，混合凝固后在25 ℃下培養5 d，以不加乳酸菌菌體的平板做對照，觀察平板禾谷鐮刀菌生長情況。

取平板培養物放入離心管中，搗碎并加入5 mL蒸餾水，按1 g培養物加入到5 mL蒸餾水，在搖床中振蕩混勻3 h，按DON試劑盒測定濾液的毒素質量濃度。

1.2.6 乳酸菌上清液對禾谷鐮刀菌生長及DON生物合成的影響

將活化乳酸菌接入到麥芽汁培養基中，30 ℃下培養18 h，離心后得到上清液，將其在旋轉蒸發儀中濃縮16倍，過濾除菌，再分別稀釋至原濃度的8倍、4倍、2倍、1倍濃度，取1 mL各濃度上清液與4 mL濃度為1×105個孢子/mL的禾谷鐮刀菌菌液混合加入到無菌平板中，再加入50 ℃左右的麥芽汁瓊脂培養基，混合凝固后在25 ℃下培養5 d，以不加乳酸菌菌體的平板做對照，觀察平板禾谷鐮刀菌生長情況。

取平板培養物放入離心管中，搗碎并加入5 mL蒸餾水，按1 g培養物加入到5 mL蒸餾水，在搖床中振蕩混勻3 h，按DON試劑盒測定濾液的毒素質量濃度。

1.2.7 乳酸菌細胞對DON吸附作用分析

采用改良的FRANCO方法[15]，將活化乳酸菌接入到麥芽汁培養基中，在30 ℃下培養18 h，各取4 mL菌液，一份煮沸使細胞失活，另一份做對照，離心后用PBS緩沖液清洗菌體2次，再用無菌水清洗菌體2次，加入配制的DON標準液(1 500 μg/L)，旋渦振蕩后在30 ℃培養箱中培養4 h，離心測定上清液中毒素質量濃度。

1.2.8 乳酸菌鑒定

1.2.8.1 乳酸菌生理生化試驗

按照梅里埃碳水化合物鑒定試劑條(API50CHL)的說明書進行測試，記錄相關結果。

1.2.8.2 乳酸菌分子生物學鑒定

將菌株進行純培養，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌DNA，然后利用細菌通用引物進行序列擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析純化后，送去無錫天霖生物公司測序。將測得序列在NCBI網站上進行Blast比對，選取同源性較高的模式菌株序列，構建發育進化樹[16]。

1.2.9 數據處理

2 結果與分析

2.1 乳酸菌篩選

從土壤、酸菜等發酵食品樣品中分離得到革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性，且在KMnO4-KBr-MRS培養基中透明圈大于10 mm的菌株58株，初步認定為乳酸菌，編號并甘油管冷凍保藏。

2.2 乳酸菌抑菌實驗

大部分乳酸菌對禾谷鐮刀菌都表現出一定的抑制效果，表1陳列了抑菌直徑大于40 mm的乳酸菌菌株編號，可以看出，A14-2菌株抑制效果最強。

表1 乳酸菌對禾谷鐮刀菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of lactic acid bacteria A14-2 onFusarium graminearum

2.3 乳酸菌培養物的抑菌特性分析

2.3.1 熱處理對乳酸菌上清液抑制活性影響

不同溫度處理上清液，其對抑菌活性影響如圖2所示， 60 ℃水浴處理10 min其抑菌活性相對空白對照組無顯著差異，而80 ℃甚至100 ℃處理上清液，其抑菌活性相對空白對照組下降顯著，降幅達到26%，說明上清液中存在某種熱不穩定性抑菌物質，可能是蛋白類物質。

圖2 不同處理溫度對乳酸菌上清液抑菌活性影響Fig.2 Effect of heat treatments on the antimicrobial activity of cell-free solution

2.3.2 酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

上清液經過蛋白酶、過氧化氫酶處理后，對禾谷鐮刀菌抑制效果的影響結果如圖3所示，乳酸菌上清液經酸性蛋白酶和中性蛋白酶處理，其抑菌率相對空白對照幾乎沒有發生變化，而經胃蛋白酶、胰蛋白酶處理，其對鐮刀菌抑制率從74.8%分別下降到69.1%和70.5%，變化顯著(p<0.05)，說明上清液中存在某些蛋白類物質對鐮刀菌生長具有一定的抑制作用。用過氧化氫酶處理上清液，其抑菌活性變化不明顯，所以可以排除過氧化氫的抑菌作用。

圖3 不同蛋白酶處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響Fig.3 Effect of protease enzyme treatments on the antimi-crobial activity of cell-free solution

2.3.3 pH值處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響

結果如表2所示，可以看出，將上清液pH值調至5.0、6.0，其對禾谷鐮刀菌抑制效果消失，說明濃縮乳酸菌上清液的抑菌活性受pH值變化影響較大，可能是有機酸類物質。

表2 pH值處理對乳酸菌上清液抑菌活性影響Table 2 Effect of pH treatments on the antimicrobial activity of cell-free supernatant

2.4 麥芽汁培養基中乳酸菌生長及產酸

將活化乳酸菌按10%接種量接入麥芽汁培養基中，30 ℃下培養18 h，測定其600 nm下吸光度、pH值及總酸，以空白培養基做對照，結果見圖4。

圖4 乳酸菌A14-2在麥芽汁培養基中生長特性Fig.4 Growth characteristics of Lactobacillus strain A14-2 in wort-based substrate

從結果可以看出，0～18 h發酵液pH值逐步降低，OD600值和總酸呈直線上升狀態，在18 h之后，乳酸菌發酵液OD值增加變得緩慢，酸度不再增加，pH幾乎不再變化，說明18 h時乳酸菌生長達到了穩定期。

2.5 乳酸菌抑制禾谷鐮刀菌生長及DON的生物合成

將乳酸菌混合禾谷鐮刀菌，在麥芽汁培養基中培養5 d后，可以觀察到添加乳酸菌的麥芽汁平板中禾谷鐮刀菌生長都被完全抑制，測定各平板培養物中嘔吐毒素質量濃度，結果如圖5所示，可以看出，只添加1 mL乳酸菌菌體，DON抑制率就超過了90%，說明乳酸菌在培養基中不僅能夠抑制禾谷鐮刀菌生長，也顯著降低了其DON的產生。

圖5 不同添加量下乳酸菌A14-2對DON生物合成的抑制作用Fig.5 Inhibition of DON production by different amount oflactic acid bacteria

2.6 乳酸菌上清液抑制禾谷鐮刀菌生長及DON的生物合成

各培養基禾谷鐮刀菌生長情況如圖6所示。

a-空白對照；b-添加1倍濃縮上清液；c-添加2倍濃縮上清液；d-添加4倍濃縮上清液；e-添加8倍濃縮上清液；f-添加16倍濃縮上清液圖6 乳酸菌上清液對禾谷鐮刀菌生長抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of lactic acid bacteria supernatant on Fusarium growth

從圖6可以看出，相對空白對照(圖6-a)，1倍(圖6-b)、2倍(圖6-c)濃度乳酸菌上清液對禾谷鐮刀菌生長未顯示出明顯的抑制效果，4倍(圖6-d)、8倍(圖6-e)、16倍(圖6-f)濃度乳酸菌上清液則非常顯著抑制了禾谷鐮刀菌生長，不同濃度乳酸菌上清液對DON產生抑制率測定結果如圖7所示，DON抑制率隨著乳酸菌上清液濃度的增加變化顯著，雖然圖7中低濃度的乳酸菌上清液對生長的抑制作用不明顯，但對DON生物合成的抑制也已經達到15%～21%，并且上清液濃度越高，其對禾谷鐮刀菌DON的生物合成的抑制作用越強，最大可達到91%。

圖7 不同濃度乳酸菌上清液對DON生物合成的抑制作用Fig.7 Inhibition of DON production by different concentrations of Lactobacillus supernatant

2.7 乳酸菌菌體細胞對DON吸附作用

從2.5和2.6結果可知，禾谷鐮刀菌與1 mL乳酸菌細胞共同培養不僅生長受到顯著抑制，其DON生物合成量也被抑制了90%，但與對應的乳酸菌上清液共同培養時，生長受抑制作用非常不明顯，其DON生物合成量也僅僅被抑制了15%，2者之間存在差異是否由于乳酸菌細胞本身吸附毒素的作用而導致的，為此進一步進行了菌體細胞對DON吸附作用分析，細胞分別進行非滅活和熱滅活處理后加入到DON溶液中，處理后測定上清液中DON質量濃度，結果如表3所示，從結果可以看出，無論滅活與否，乳酸菌A14-2細胞本身并不能夠通過吸附作用降低溶液中DON質量濃度。

表3 乳酸菌對DON吸附作用測定結果Table 3 The determination results of LAB bind of DON

2.8 乳酸菌A14-2菌株的鑒定

2.8.1 乳酸菌生理生化鑒定

梅里埃API50CHL試劑盒測定結果如表4所示，根據鑒定結果分析可以初步確定A14-2菌株為植物乳桿菌。

表4 乳酸菌A14-2菌株的API50CHL生理生化反應結果Table 4 Physiological and biochemical reaction of A14-2 strain by API50CHL

注：“-”代表陰性；“+”代表陽性。

2.8.2 乳酸菌分子生物學實驗

將乳酸菌菌株A14-2的PCR產物測序并進行同源性比對，構建系統發育進化樹結果如圖8所示，A14-2和植物乳桿菌NBRC 15891親緣性更近，結合API50CHL碳水化合物利用情況，可以確定A14-2為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

圖8 乳酸菌A14-2的16SrDNA序列系統發育樹Fig.8 Polygenetic tree of A14-2 strain based on the complete 16S rDNA sequence

3 討論

本研究從發酵食品中分離得到1株對禾谷鐮刀菌具有高拮抗活性的乳酸菌株A14-2，經生理生化及分子鑒定為植物乳桿菌，對該菌抑菌有效成分分析結果顯示，其對熱較敏感，對pH值變化異常敏感，但對蛋白酶處理不敏感，說明其抑菌成分主要為有機酸，也包含一些非蛋白類熱敏感物質。通過將不同濃度乳酸菌菌體及發酵上清液與禾谷鐮刀菌共培養，發現乳酸菌及其上清液能夠降低禾谷鐮刀菌DON的生物合成，目前很多研究顯示乳酸菌菌體可以通過吸附作用降低溶液中DON質量濃度[17-18]，但乳桿菌A14-2并不具備這種作用，其主要作用是通過形成具有抑菌作用的代謝產物以及競爭營養物質和形成不利于禾谷鐮刀菌生長的環境影響鐮刀菌生長和抑制DON的生物合成，但對于已經存在的毒素，并不能通過細胞吸附將其去除。

禾谷鐮刀菌是谷物污染的主要病原菌，本實驗結果為利用乳酸菌降低谷物食品中嘔吐毒素含量提供了理論依據，在之后的研究中，可以進一步將這株植物乳桿菌應用于釀造行業如麥芽制造過程中，從而探究其實際應用的可行性。