免核酸提取熒光定量PCR方法應用研究

魏園園

（遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164）

分子檢測方法由于具有的高敏感性、高通量和適合的價格，越來越頻繁的應用在獸醫診斷中。在檢測過程中，常需要對檢測樣本進行核酸提取純化，需要投入大量的時間，其復雜的提取步驟容易造成交叉污染。為能更加快速準確的進行疫病檢測，免核酸提取產品成為了疫病檢測的最佳選項。本文通過對禽流感病毒培養物、臨床樣本中的病毒核酸進行研究，用以評價免核酸提取與常規核酸提取兩者在陽性符合率、病毒復制、檢測效果等方面的差異，為臨床疫病檢測監控提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本

樣本采集方法：用無菌棉拭子探入喉頭口及上顎裂來回刮3～5次取咽喉分泌液，放入加有無菌1 毫升PBS緩沖液的無菌1.5 毫升離心管中備用。樣本來源：全省抽取的5000例家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子、禽流感H5、H7、H9病毒培養樣本各選取1例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 常規熒光定量PCR檢測法 使用天根生化科技（北京）有限公司的磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，配套賽默飛KingFisher Flex全自動核酸提取儀對病毒培養物樣本、稀釋的病毒培養物樣本、臨床樣本進行核酸提取制備，提取時間為40～60分鐘。核酸提取完畢后，用QIAGEN的禽流感 H5/H7/H9熒光定量PCR試劑盒，對病毒培養物核酸、稀釋的病毒培養物核酸、臨床樣本核酸進行熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR法）檢測；將上述處理好的核酸樣本加樣上機，用ABI7500熒光定量P C R儀進行擴增，收集熒光信號，進行結果判定。本階段時間為90分鐘。整個實驗整體完成時間為130～150分鐘。

1.2.2 免提取熒光定量P C R檢測法 使用北京大有泰萊生物技術有限公司的禽流感H5/H7/H9免提取熒光定量PCR試劑盒，對病毒培養物核酸、稀釋的病毒培養物核酸、確診的臨床陽性樣本核酸進行熒光定量PCR方法進行檢測；用試劑盒配套的樣本處理液將樣本進行待檢處理，直接加樣上機，用賽默飛ABI7500熒光定量PCR儀進行擴增，收集熒光信號，進行結果判定。本階段時間為100分鐘。整個實驗整體完成時間為105～110分鐘。

2 實驗結果

2.1 常規熒光定量PCR和免提取熒光定量PCR對病毒培養物檢測結果對比

對于H5、H7和H9病毒培養物樣本，根據100、10-1、10-2、10-3和10-4的稀釋倍數，分別進行病毒核酸檢測，免提取熒光定量PCR檢測結果和傳統熒光定量PCR檢測結果一致，符合率100%。檢測數據結果見表1。

結果表明高病毒濃度的病毒培養物、低病毒濃度的病毒培養物，免核酸提取方法均能滿足準確檢測判定的需求。

2.2 常規熒光定量PCR和免提取熒光定量PCR對臨床樣本的檢測結果

對5 0 0 0份臨床樣本，用QIAGEN的常規熒光熒光定量PCR試劑盒檢測，樣本陰陽性判定結果見表2。

確診為陽性樣本的，再根據100、10-1、10-2和10-3的稀釋倍數，分別進行H5、H9病毒檢測，其陽性符合率依然一致。檢測數據見表3。

表1

結果表明高病毒濃度的臨床樣本、低病毒濃度的臨床樣本，免提取的熒光定量PCR試劑均能滿足準確檢測判定的需求。

應用免核酸提取方法對禽流感病毒H5/H7/H9亞型的病毒培養物、稀釋的病毒培養物、臨床陽性樣本、稀釋的臨床弱陽性樣本進行檢測。檢測結果與常規核酸提取熒光定量PCR檢測方法結果一致，可以滿足禽流感病毒H5/H7/H9亞型的病毒檢測需求。綜上所述，免核酸提取熒光定量PCR方法檢測的陽性復合率100%符合，且可以有效的提高實驗效率，此方法可以有效應用于動物疫病臨床監測。