丙泊酚對人胃癌裸鼠移植瘤生長的影響

胡微瀾，韓威利，杜增利

（1.河南省新鄉市中心醫院，河南 新鄉 453000；2.河南省焦作煤業集團中央醫院，河南 焦作 454150）

胃癌作為常見的消化道惡性腫瘤，具有惡性程度高、易轉移、易復發、預后較差等特點[1]，目前，手術切除是胃癌最主要的治療手段[2]，但術后易出現復發、轉移而影響患者預后[3]。丙泊酚作為常用的全身麻醉類藥物，具有麻醉誘導快，蘇醒迅速等優點，是胃癌根除術的常用麻醉藥物[4]。有研究指出，丙泊酚在抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡中發揮重要作用[5]。亦有研究指出，丙泊酚可抑制大鼠膠質瘤細胞的侵襲、遷移能力[6]。本研究通過復制裸鼠人胃癌細胞皮下瘤模型，觀察丙泊酚對胃癌裸鼠移植瘤生長的影響，并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人胃癌細胞株SGC7901（中科院上海細胞生物化學研究所），30只清潔級級雌性BALB/c裸鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）[動物合格證號：SCXK（滬）2012-00002]，4～5周齡，體重17～21 g，丙泊酚注射液（四川國瑞藥業有限責任公司）（批準文號：國藥準字H20040079），10%胎牛血清、胰酶、高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司，總RNA提取試劑盒（Trizol法）（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（美國Promega公司），擴增試劑盒（美國Axygen公司），核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）、NAD（P）H醌氧化還原酶1[NAD（P）H-quinine oxidoreductase 1, NQO1]、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）、B淋巴細胞瘤（B-cell lymphoma-2c, Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein, Bax）及內參引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，兔抗鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗人HO-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠NQO1多克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體（上海滬峰化工公司），兔抗大鼠Bax多克隆抗體（武漢博士德生物公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國ABI公司），凝膠電泳成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人胃癌細胞株SGC7901置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，在37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養箱中培養。胰酶消化后，每2、3 d傳代1次，取對數生長期細胞完成后續實驗。

1.2.2 復制裸鼠移植瘤模型及分組 取對數生長期細胞，制備細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/ml，用1 ml注射器將500μl細胞懸液注射于裸鼠右前肢皮下，之后放回籠中繼續進行飼養。2周后皮下出現5 mm大小的結節為模型復制成功，30只裸鼠模型均復制成功。將裸鼠隨機分為對照組、生理鹽水組和丙泊酚組，每組10只。對照組未做任何處理；生理鹽水組腹腔注射生理鹽水1.5 ml/kg，1次/d，連續2周。丙泊酚組腹腔注射丙泊酚20 mg/kg，1次/d，連續2周。

1.2.3 觀察指標 觀察各組裸鼠給藥前后身體變化，飲食、進水及消瘦程度等一般情況，以及腹水、淋巴結腫大、消瘦等惡病質發生情況。

1.2.4 移植瘤體積變化 給藥后每3 d用游標卡尺測量移植瘤長徑和短徑，計算移植瘤體積，移植瘤體積（mm3）=1/2×長徑×短徑2。第15天時將裸鼠脫臼處死，剝離瘤體，測量移植瘤體積，用電子天平稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=（對照組移植瘤平均體質量-生理鹽水組或丙泊酚組移植瘤平均體質量）/對照組移植瘤平均體質量×100%[7]。

1.2.5 qRT-PCR 采用qRT-PCR檢測各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因的表達。取各組裸鼠移植瘤組織，研磨后加入細胞裂解液進行裂解，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，采用紫外分光光度法檢測總RNA的純度并定量。用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物序列：Nrf2正向引物：5’-ACACGGTCCACAGCTCATC-3’，反向引物：5’-TGTCAATCAAATCCATGTCCTG-3’；NQO1正向引物：5’-CAGAAATGACATCACAGGTGAGC-3’，反向引物：5’-CTAAGACCTGGAAGCCACAGAAA-3’；HO-1正向引物：5’- GCTCGAATGAACACTCTG GAGAT-3’，反向引物：5’-TCCAGAGAGAAAGGAA ACACAGG-3’；Bcl-2 正向引物：5’-CACAAGAGGCCA AGGCTACCT-3’，反向引物：5’-CAGGAAAGCAGG AAGTCTCAA-3’；Bax正向引物：5’-ATTGAGAAA CGATTTGCCTACA-3’，反向引物 ：5’-GGGAAAT GGCTTATTCTCCTTTGCTT-3’；β-actin正向引物：5’-TTGCCGACAGGATGCAGAAGGA-3’，反向引物：5’-AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3’。PCR 反應條件：94℃預變性1 min，92℃變性30 s，58℃退火30 s，73℃延伸30 s，共36個循環，每個樣品設置3個平行反應復孔。用2-△△Ct法計算裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因相對表達量[8]。

1.2.6 Western blot檢測 采用Western blot檢測各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量。取各組裸鼠移植瘤組織，研磨后加入細胞裂解液進行裂解，用總蛋白提取試劑盒提取組織中總蛋白，用BCA總蛋白檢測試劑盒檢查總蛋白濃度。取30μg總蛋白，100℃變性后，進行電泳分離，電轉移至聚偏氟乙烯膜，室溫下用脫脂奶粉封閉60 min。分別加入一抗兔抗鼠Nrf2多克隆抗體、兔抗小鼠NQO1多克隆抗體、兔抗人HO-1多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體及兔抗大鼠Bax多克隆抗體（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶800、1∶1200、1∶500和1∶1 000），室溫下孵育120 min，4℃過夜孵育，加入二抗，室溫孵育60 min，加入ECL發光試劑后避光反應25min，拍照。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析條帶灰度值，獲得各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量[9]。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用重復測量設計的方差分析或單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗；不符合正態分布則采用秩和檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠一般情況

給藥后15 d，與丙泊酚組相比，對照組和生理鹽水組裸鼠出現進水、飲食量顯著減少，體形消瘦明顯；對照組、生理鹽水組分別有4和3只裸鼠出現淺表淋巴結腫大，且移植瘤周圍出現大小不等的衛星癌灶。與給藥前相比，丙泊酚組裸鼠進水正常，飲食量略有減少，體重稍減輕，未發生腹水或淋巴結腫大，移植瘤周圍未見衛星癌灶。

2.2 各組裸鼠不同時間點移植瘤體積比較

丙泊酚組、對照組、生理鹽水組裸鼠給藥前，以及給藥后3、6、9、12和15 d時的移植瘤體積比較，采用重復測量設計方差分析，結果：①不同時間點的移植瘤體積有差異（F=34.357，P=0.000）；②3組裸鼠移植瘤體積有差異（F=86.172，P=0.000），丙泊酚組的移植瘤體積小于對照組和生理鹽水組（P＜0.05）；③3組裸鼠移植瘤體積變化趨勢有差異（F=18.394，P=0.000）。見表 1。

2.3 各組裸鼠移植瘤體質量和抑瘤率比較

丙泊酚組、對照組、生理鹽水組裸鼠移植瘤體質量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，丙泊酚組裸鼠移植瘤體質量低于對照組和生理鹽水組（P＜0.05）。丙泊酚組、對照組、生理鹽水組抑瘤率比較，經秩和檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），丙泊酚組抑瘤率高于對照組。見表2。

表1 3組裸鼠各時間點移植瘤體積比較 （n =10，mm3，±s）

表1 3組裸鼠各時間點移植瘤體積比較 （n =10，mm3，±s）

注：?與對照組、與生理鹽水組比較，P ＜0.05

組別 給藥前 給藥后3 d 給藥后6 d 給藥后9 d 給藥后12 d 給藥后15 d對照組 54.2±14.8 143.4±35.0 282.4±57.3 439.6±65.9 621.8±70.2 863.5±78.3生理鹽水組 53.9±13.4 145.3±30.6 274.1±54.8 421.2±66.3 614.7±65.4 871.4±88.5丙泊酚組 54.8±15.3 98.3±23.7? 224.2±41.1? 351.6±55.1? 406.5±59.8? 512.6±70.8?

表2 各組裸鼠移植瘤體質量和抑瘤率比較 （n =10）

2.4 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax基因表達水平比較

丙泊酚組、對照組、生理鹽水組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2 mRNA相對表達量低于對照組和生理鹽水組（P＜0.05），而Bax mRNA相對表達量高于對照組和生理鹽水組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表達水平比較 （n =10，±s）

表3 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax mRNA表達水平比較 （n =10，±s）

注：?與對照組、生理鹽水組比較，P ＜0.05

組別 Nrf2 mRNA NQO1 mRNA HO-1 mRNA Bcl-2 mRNA Bax mRNA對照組 1.92±0.13 1.58±0.12 1.69±0.13 1.84±0.17 1.14±0.16生理鹽水組 1.90±0.11 1.56±0.10 1.72±0.15 1.83±0.16 1.16±0.18丙泊酚組 1.28±0.14? 1.10±0.08? 1.17±0.10? 1.21±0.13? 1.75±0.14?F值 114.785 69.730 68.887 53.821 45.213 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

丙泊酚組、對照組、生理鹽水組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量低于對照組和生理鹽水組（P＜0.05），而Bax蛋白相對表達量高于對照組和生理鹽水組（P＜0.05）。見表4和附圖。

表4 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

表4 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較 （n =10，±s）

注：?與對照組、生理鹽水組比較，P ＜0.05

組別 Nrf2蛋白 NQO1蛋白 HO-1蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對照組 0.83±0.09 0.65±0.12 0.75±0.14 0.78±0.08 0.35±0.10生理鹽水組 0.84±0.11 0.67±0.14 0.76±0.12 0.80±0.11 0.34±0.09丙泊酚組 0.49±0.13? 0.29±0.08? 0.38±0.07? 0.42±0.13? 0.68±0.13?F值 30.585 23.466 58.075 42.889 15.610 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

附圖 各組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白的表達

3 討論

胃癌細胞具有較強的增殖、遷移及侵襲能力，這是導致胃癌進展迅速、預后不良的重要原因[10]。有效抑制胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，對提高療效、改善預后具有重要意義。胃癌細胞增殖、遷移、侵襲過程是多基因、多步驟共同作用的結果，其具體作用機制尚未完全清楚。

丙泊酚是臨床上常用的麻醉類藥物，具有良好的麻醉誘導和維持效果，常用于腫瘤根治性手術[11]。近年來研究發現，丙泊酚具有一定的抗腫瘤作用[12]。白建杰等[13]指出，丙泊酚可下調人乳腺癌MDAMB-231細胞中H19的表達而抑制細胞遷移、侵襲過程。賴曉紅等[14]亦采用離體細胞實驗表明，丙泊酚可通過抑制RhoA/ROCK1信號通路，降低人胃癌細胞的轉移能力。張健[15]指出，丙泊酚可誘導肝癌細胞凋亡。本研究利用人胃癌細胞株SGC7901復制裸鼠胃癌移植瘤，結果顯示，丙泊酚組裸鼠給藥后3、6、9、12和15 d時移植瘤體積均低于對照組和生理鹽水組，說明丙泊酚可抑制裸鼠移植瘤生長；15 d時將3組裸鼠處死，對移植瘤進行稱重，結果丙泊酚組裸鼠移植瘤體質量降低，而抑瘤率升高，說明丙泊酚具有抗胃癌移植瘤生長的作用，在抑制胃癌移植瘤生長中發揮重要作用。

Nrf2作為一種重要的轉錄因子，是細胞氧化應激反應中的關鍵性因子，在調控氧化還原平衡、細胞代謝、增殖及凋亡過程中發揮重要作用。研究發現，Nrf2可與抗氧化反應元件（antioxidant response element, ARE）結合，啟動多種解毒酶、抗氧化基因的表達，如HO-1、NQO1等，保護細胞免于受損[17]。也有研究表明，Nrf2/ARE通路參與多種腫瘤的生長、轉移過程，是重要的抗腫瘤治療靶位[18]。有研究指出，下調Nrf2和下游靶基因的表達可抑制肺癌A549細胞的增殖和轉移[19]。應鎮光等[20]指出，Nrf2/ARE信號通路參與胃癌發生及耐藥性的產生。本研究結果顯示，與對照組和生理鹽水組相比，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Nrf2、NQO1、HO-1基因和蛋白相對表達量均降低，說明丙泊酚可能通過抑制Nrf2/ARE信號通路而發揮抗腫瘤作用。

Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的重要基因，Bcl-2可保護細胞避免凋亡，Bax則在促進細胞凋亡中發揮重要作用[21]。本研究結果顯示，丙泊酚組裸鼠移植瘤組織中Bcl-2基因和蛋白相對表達量降低，而Bax基因和蛋白相對表達量升高，說明丙泊酚促進移植瘤組織細胞凋亡的發生。筆者推測丙泊酚可能通過抑制Nrf2/ARE信號通路及下游保護性基因的表達，促進細胞發生凋亡。

綜上所述，丙泊酚可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生長，其機制可能與抑制Nrf2/ARE信號通路，而促進細胞凋亡有關。