LC-MS/MS法分析人血漿中西格列汀濃度及其應用研究

劉珊珊，夏媛媛，劉靜媛，耿雅杰，魏廣力，司端運△

糖尿病是由胰島素分泌過少或作用缺陷引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，病因復雜。西格列汀是世界上首個上市的二肽激肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，通過抑制血清DPP-Ⅳ的活性，達到控制血糖的效果［1-2］。目前測定人血漿中西格列汀濃度的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［3］、激光二極管熱解吸-串聯質譜法［4］、氣相色譜-串聯質譜法（GC―MS/MS）［5］和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）［6-8］。既往文獻中采用LC-MS/MS法測定血漿中西格列汀濃度時，血漿樣品的前處理過程大多采用液液萃取的方法，處理過程繁瑣費時，并且大量的有機溶劑會造成環境污染。本課題組在血漿樣品的前處理過程中首次使用高通量96孔CleanertPPT沉淀板，操作簡單快速，僅需要氣源，可在惰性氣體（氮氣）環境下完成，減少了離心等操作，用時較短，重現性好?；诖?，本文按照2015年版中國藥典中的《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》建立了一種簡單可靠、快速、準確、敏感度高的LC-MS/MS分析方法，用于定量分析人血漿中西格列汀的濃度，為西格列汀在人體內的藥代動力學研究提供了方法學基礎，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 磷酸西格列汀標準品（純度98%，批號15-SCC-61-1）、磷酸西格列汀-d4標準品（化學純度97.11%，同位素純度99.8%，批號12-SHG-101-1）均購于Toronto Research Chemicals；甲醇、乙腈(色譜級）購于美國Fisher公司；甲酸銨（分析純，批號20150731）購于天津市光復科技發展有限公司；無水甲酸（優級純，批號20150515）購于天津市光復精細化工研究所；去離子水由實驗室自制。磷酸西格列汀片（捷諾維，規格：100 mg/片）由Merck Sharp Dohme生產。8名健康成年志愿者由首都醫科大學附屬北京地壇醫院招募。志愿者在給藥前采集的血漿為空腹空白血漿，從8名受試者的空腹空白血漿中任取其中6個，即為6個不同來源人空腹空白血漿。

1.2 儀器 Prominence20A液相色譜儀（日本Shimadzu公司），配備LC-20AD型輸液泵，DGU-20A3型脫氣機，CTO-20A型柱溫箱，SIL-20A型自動進樣器；Sciex TRIPLE QUADTM4000 Q-TRAP型三重四極桿串聯質譜儀（美國Applied Biosystems公司），配有ESI離子源及Analyst1.5.2數據處理軟件；XS105型分析天平（瑞士METTER TOLEDO公司）；TARGINTMVX-II型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；MULTI SPE-M96型固相萃取裝置（天津博納艾杰爾科技有限公司）；BM-40型純水制備系統（北京中盛茂源科技發展有限公司）。

1.3 標準品溶液的配制 精密稱取適量磷酸西格列汀標準品，用甲醇稀釋得到系列標準工作液（濃度分別為0.01、0.02、0.1、0.4、2、16、20 mg/L）和質控工作液（濃度分別為0.03、1.5、5、15 mg/L）。精密稱取適量磷酸西格列汀-d4標準品，用甲醇稀釋得200 μg/L的內標工作液。

1.4 人血漿標準曲線以及質控樣品的配制 精密吸取人的空白血漿475 μL，加入25 μL系列標準工作液或質控工作液，得到濃度范圍為0.5～1 000 μg/L的血漿標準曲線樣品，以及濃度為1.5、75、250、750 μg/L的血漿質控樣品。

1.5 生物樣品處理方法 向CleanertPPT沉淀板內加入300 μL甲醇，100 μL內標工作液，100 μL含藥血漿后，渦旋 5 min，靜置5 min，加氮氣正壓將溶液壓過沉淀板，收集下清液至收集板中，進樣5 μL，進行LC-MS/MS定量分析。

1.6 色譜條件 譜柱為Diamonsil C18柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為40℃。流動相中的有機相（A）為甲醇、水相（B）為10 mmol/L甲酸銨水溶液（含10%甲醇，0.1%甲酸）。梯度洗脫：0～0.5 min 60%B，0.5～2.0 min 60%B→20%B，2.1～4.5 min 20%B，4.5～4.6 min 20%B→60%B，4.6～7.0 min 60%B；色流速為0.5 mL/min，儀器運行時間為7 min，進樣5 μL。

1.7 質譜條件 采用ESI電噴霧離子化源，多反應（MRM）正離子檢測模式進行定量檢測；檢測參數：卷簾氣20 psi（1 psi=6.9 kpa），碰撞氣10 psi，噴霧電壓3 000 V，源溫度500 ℃，碰撞出口電壓15 V。

1.8 方法學驗證 本研究嚴格按照2015年版中國藥典《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》中的相關規定，對建立的LC-MS/MS方法進行方法學驗證，評價該方法的可行性。

1.8.1 選擇性 隨機取6個健康志愿者的空腹血漿，除不加內標溶液（改加同等體積的甲醇）外，其余按1.5中步驟進行LC-MS/MS分析。通過比較人空白血漿樣品、定量下限（LLOQ）的血漿樣品（以血漿標準曲線的最低濃度點0.5 μg/L作為定量下限）、人口服西格列汀片后的血漿樣品，考察該方法的特異性。

1.8.2 進樣殘留情況 為考察進樣殘留情況，按曲線最高濃度、空白人血漿樣品的順序進樣分析，考察殘留情況。

1.8.3 線性范圍與定量下限 配制并處理標準曲線樣品進行LC-MS/MS分析，以待測物濃度X（μg/L）為橫坐標，待測物與內標物峰面積比值 為縱坐標，采用加權最小二乘法（權重為1/x2）進行回歸運算，標準曲線的回歸方程為=aX+b。按照1.5中步驟配制并處理LLOQ樣品（濃度為0.5 μg/L），進行LC-MS/MS分析，考察3個分析批，每批6個樣本，計算批內和批間的精密度以及準確度。

1.8.4 準確度與精密度 按照1.5中步驟配制并處理濃度為1.5、75、250、750 μg/L質控樣品，進行LC-MS/MS分析。連續考察3個分析批，每批、每個濃度6個樣本。應用當批標準曲線計算各質控樣品的濃度，考察分析方法的準確度和精密度。

1.8.5 基質效應和回收率 配制濃度為1.5、75、250、750 μg/L的質控血漿樣品，每一濃度平行測定6個樣本，得峰面積A。人空白血漿樣品按1.5中步驟取下清液并經氮氣吹干后，用相應濃度溶液樣品復溶，每一濃度平行測定6個樣本，得峰面積B；濃度為1.5、75、250、750 μg/L溶液樣品進樣得峰面積C，每一濃度平行測定6個樣本。計算基質效應和回收率，西格列汀回收率=A/B×100%，基質效應=B/C×100%；同法計算內標回收率和基質效應。

1.8.6 穩定性 配制濃度為1.5、750 μg/L的血漿樣品，分別考察室溫放置4 h、-20℃凍存55 d、-20℃室溫3次凍融循環、處理后自動進樣器6℃放置48 h的穩定性，按1.5中步驟操作，各濃度水平均為6個樣本。配制濃度為1.5、750 μg/L的含藥全血，分別于0 h、室溫放置1 h后離心，取血漿按1.5中步驟操作，考察西格列汀在全血中的穩定性，各濃度水平均為6個樣本。

1.8.7 臨床藥代動力學樣品檢測 8名健康成年志愿者進行單次口服磷酸西格列汀片的藥動學實驗，受試者于給藥日早上空腹（禁食10 h）口服捷諾維100 mg。分別于給藥前和給藥后20、40 min，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12、16、24、36、48、72 h采集血樣至肝素鋰抗凝管中，在4 ℃，3 000 r/min條件下離心10 min，分離血漿，保存于-20℃，運送到本實驗室進行樣品檢測。

2 結果

2.1 質譜分析 在二級掃描模式下，西格列汀及內標西格列汀-d4生成的主要產物離子分別為m/z235.2和m/z239.0，質譜圖見圖1。

Fig.1 The chemical structures and product ion mass spectrum of the［M+H］+ions of sitagliptin（A）,sitagliptin-d4(B)(internal standard)圖1 西格列汀和內標西格列汀-d4的化學結構和質譜掃描圖

2.2 方法學驗證

2.2.1 選擇性 空白血漿樣品的色譜圖見圖2A，LLOQ樣品的代表性色譜圖見圖2B，人空腹口服給藥8 h后樣品的代表性色譜圖見圖2C。西格列汀和內標西格列汀-d4的色譜保留時間分別為3.67 min和3.66 min。結果表明干擾組分的響應低于該批次LLOQ待測物響應的20%及內標響應的5%，表明人血漿中的內源性物質不干擾待測物和內標的定量分析。

Fig.2 Representative MRM chromatograms of sitagliptin and sitagliptin-d4 in human plasma圖2 西格列汀和西格列汀-d4的典型色譜圖

2.2.2 進樣殘留情況 為考察進樣殘留情況，曲線最高濃度進樣后，分析空白人血漿樣品。結果顯示，空白人血漿中干擾組分的響應低于當批次LLOQ待測物響應的1/5，內標響應的1/20，不影響人血漿中西格列汀濃度的定量分析。

2.2.3 線性范圍和定量下限 線性范圍為0.5～1 000 μg/L的典型回歸方程為=0.008 09X+0.000 527，R2=0.998 6。結果表明西格列汀在0.5～1 000 μg/L的范圍內線性關系良好。LLOQ樣品的代表性色譜圖見圖2B，相關數據見表1。在LLOQ濃度下，西格列汀色譜峰的信噪比（S/N）＞10，準確度為108%，批內精密度為3.42%～8.22%，批間精密度為12.8%，表明本方法測定人血漿中西格列汀濃度的LLOQ可以達到0.5 μg/L。

Tab.1 Analysis of precision and accuracy for the sitagliptin in hum an plasma表1 西格列汀在人血漿中的精密度和準確度分析（n=18，±s）

Tab.1 Analysis of precision and accuracy for the sitagliptin in hum an plasma表1 西格列汀在人血漿中的精密度和準確度分析（n=18，±s）

濃度（μg/L）標準質控濃度0.5 1.5 75 250 750實測值0.54±0.04 1.64±0.05 82.30±2.64 247.00±9.70 765.00±18.50精密度（%）批內3.42～8.22 2.01～4.16 1.20～3.33 0.83～5.93 0.84～3.46批間12.80 2.12 6.78 5.90 2.69準確度（%）108 109 110 99 102

2.2.4 準確度與精密度 西格列汀各濃度質控樣品的準確度平均在99.0%～110%之間，批內精密度為0.83%～5.93%，批間精密度為2.12%～6.78%，均符合有關生物樣品分析方法驗證的要求，見表1。

2.2.5 基質效應和回收率 對于6個受試者的空腹血漿樣本，西格列汀在1.5、75、250、750 μg/L 4個濃度上的內標歸一化的基質效應為99.2%、99.9%、99.7%、99.7%，基質效應的精密度小于1.80%，說明基質效應不會對樣品的分析產生影響。西格列汀在1.5、75、250、750 μg/L 4個質控濃度上的回收率在89.3%～104.0%之間；內標的平均回收率為96.4%，結果說明回收率較高，不會對樣品的分析產生影響。

2.2.6 穩定性 西格列汀的含藥血漿在不同貯存條件下穩定性良好，準確度在93.8%～110%之間，見表2。含藥全血的穩定性結果見表3，表明含藥全血室溫放置1 h穩定。

Tab.2 Stability of sitagliptin in hum an plasma表2 西格列汀在人血漿中的穩定性 （n=6，±s）

儲存條件 濃度（μg/L）室溫放置4 h三次凍融循環-20℃放置55 d自動進樣器放置48 h標準濃度1.5 750 1.5 750 1.5 750 1.5 750實測值1.60±0.07 772.00±6.08 1.57±0.10 704.00±37.40 1.64±0.051 784.00±4.55 1.62±0.052 766.00±7.78精密度（%）4.29 0.79 6.54 5.31 3.06 0.58 3.18 1.02準確度（%）107 103 104 93.8 110 105 108 102

2.2.7 人體藥代動力學研究 采用WinNonlin 7.0軟件，非房室模型計算藥代動力學參數，8例健康成年受試者單次口服100 mg磷酸西格列汀片后，西格列汀的平均血藥濃度-時間曲線見圖3。相應的藥動學參數見表4。

Fig.3 Mean plasma concentration of sitagliptin over time after oral administration of sitagliptin tablet 100 mg in 8 healthy adult volunteers圖3 8例健康成年志愿者單次口服西格列汀片100 mg平均血藥濃度-時間曲線

Tab.4 The pharmacokinetic parameters after oral adm inistration of sitagliptin(100 mg/tablet)表4 單劑量口服西格列汀片100 mg后的主要藥動學參數（n=8，±s）

Tab.4 The pharmacokinetic parameters after oral adm inistration of sitagliptin(100 mg/tablet)表4 單劑量口服西格列汀片100 mg后的主要藥動學參數（n=8，±s）

Cmax：達峰濃度；Tmax：達峰時間；AUC：生物利用度；MRT：平均滯留時間；Vd：表觀分布容積；CL：清除率；T1/2：半衰期

指標C max（μg/L）T max（h）AUC0-72h（h·μg/L）AUC0-∞（h·μg/L）MRT0-72 h（h）藥動學參數375±138 2.44±1.29 2 915±585 2 936±587 9.72±1.19指標MRT0-∞（h）Vd（L）CL（L/h）T1/2（h）藥動學參數10.20±1.34 563±160 35.10±5.77 11.10±2.41

3 討論

隨著人們熱量攝入的增加和體力活動的減少，世界范圍內糖尿病的患病率正在逐年增加，成為發病率最高的慢性病之一。根據國際糖尿病聯盟的相關報告，2011年全球糖尿病患者已達到3.66億，2030年預計將達到5.52億，患病率約7.7%。糖尿病根據發病機制不同可分為1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病是代謝紊亂導致的一種復雜疾病，是生活環境與遺傳因素的相互作用導致的胰島素抵抗［9］。

西格列汀是一種口服的強效選擇性DPP-Ⅳ抑制劑，與運動、飲食相結合用于治療2型糖尿病。相比于磺酰脲類等傳統降糖藥，降低了患者發生低血糖的風險，并且該藥對控制患者的體質量與血壓也有裨益［10-13］。

為了建立一種簡便、選擇性好、敏感度高的LCMS/MS方法，本研究對質譜、色譜及樣品處理方法進行了優化。選擇了響應高、特異性強的正離子掃描、多反應檢測模式，進一步優化了分子離子、碎片離子及各項質譜條件；由西格列汀結構可知其極性相對較弱，因此在C18的反相色譜柱上有保留。Suresh等［14］也多采用C18柱，本課題組在預實驗時考察了DiamonsilC18、 ZORBAX Eclipse XDB - C18、SymmetryC18、等不同色譜柱，發現保留順序是DiamonsilC18＞SymmetryC18＞ZORBAX Eclipse XDBC18，分析物在DiamonsilC18柱上有較好保留，因此被選中并進一步優化。本實驗同時對洗脫方式進行了優化，實驗開始采用等度洗脫（有機相/水相為80∶20），出峰較早，峰形較寬并且拖尾，隨后改為梯度洗脫（0～0.5 min 60%B，0.5～2.0 min 60%B→20%B，2.1～4.5 min 20%B，4.5～4.6 min 20%B→60%B，4.6～7 min 60%B）；開始采用高比例水相，可使其出峰延后，中間增大有機相比例，增強其洗脫能力，結果發現保留時間延后并且拖尾改善峰形變好。國內文獻報道測定人血漿中西格列汀濃度LC-MS/MS方法中大多采用了液液萃取的方法，耗時費力［6-8］。本研究在考察血漿樣品處理方法時，開始選擇了簡單的沉淀蛋白，但直接沉淀的方法存在一定的基質效應和內源性干擾；進一步考慮采用CleanertPPT沉淀板，處理過程中有機溶劑沉淀的蛋白吸附于沉淀板內，沉淀干凈完全，適用于高黏度血液樣品，并且基質效應影響低、回收率高。在內標的選擇上，選擇了待測物的穩定同位素標志物為內標，其色譜保留行為、穩定性、基質效應、回收率以及質譜條件等與待測物一致。

查閱文獻［15-20］發現，健康志愿者口服100 mg西格列汀片后，達峰濃度在200～500 μg/L之間，本研究設定的線性范圍為0.5～1 000 μg/L，既能滿足實際測樣的高濃度需求，又避免了對樣品再進行稀釋處理；所有受試人體的AUC0-t/AUC0-∞的比例均大于80%，也滿足實際測樣的低濃度需求，保證能夠實施完整的人體生物樣本濃度研究。

中國藥典2015年版《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》和EMEA 2011版藥品評價指導原則中對分析方法驗證的要求基本一致，故本文建立的分析方法嚴格遵守2015年版藥典中規定的《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》，并對該方法的選擇性、殘留、線性、準確度、精密度、敏感度、穩定性、基質效應等項目進行了系統的方法學驗證，可滿足藥物臨床藥代動力學研究的技術要求。此外，本分析方法可靠，能夠準確測定人血漿中西格列汀的濃度，評價西格列汀在健康人體內的藥代動力學行為，可用于支持該藥物仿制藥的生物等效性評價。