救必應(yīng)酸的單體制備及RP—HPLC法測(cè)定救必應(yīng)藥材及精制品中3種活性成分的含量

王圓　高兵　陳華　張雷

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）03-0326-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.09

摘 要 目的：制備高純度的救必應(yīng)酸并測(cè)定救必應(yīng)藥材及精制品中3種活性成分紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量。方法：采用醇提法制備救必應(yīng)皂苷，以甲醇和氫氧化鈉進(jìn)一步水解，并經(jīng)重結(jié)晶后得到救必應(yīng)酸單體。采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定救必應(yīng)藥材及精制品1和精制品2中紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量。色譜柱為Agilent XDB C18，流動(dòng)相為水-乙腈（梯度洗脫），柱溫為30 ℃，流速為1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：所制救必應(yīng)酸純度達(dá)99%以上。紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸進(jìn)樣量分別在0.18～3.22、0.59～10.36、0.20～3.53 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r均為0.999 9），精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%（n=6～7），平均加樣回收率為96.08%～100.81%（RSD≤1.98%，n=6）。紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量在救必應(yīng)藥材中分別為1.61%、7.26%、1.29%（RSD≤1.08%，n=3），在精制品1中分別為0、82.59%、4.18%（RSD≤1.67%，n=3）；在精制品2中分別為0、73.29%、7.41%（RSD≤1.15%，n=3）。結(jié)論：所制救必應(yīng)酸純度高、制備方法簡(jiǎn)單且安全環(huán)保。建立的RP-HPLC法簡(jiǎn)單、可靠，可滿足快速測(cè)定救必應(yīng)藥材及其精制品含量的要求。

關(guān)鍵詞 救必應(yīng)；紫丁香苷；長(zhǎng)梗冬青苷；救必應(yīng)酸；制備；反相高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare high-purity rotundic acid， and to determine the contents of syringoside， peduncloside and rotundic acid in Ilicis rotundae and its refined products. METHODS： I. rotundae saponins was prepared by ethanol extraction method and hydrolyzed with methanol and sodium hydroxide； rotundic acid monomer was obtained after recrystallization. The contents of syringoside， peduncloside and rotundic acid in I. rotundae， its refined product 1 and its refined product 2 were determined by RP-HPLC. The determination was performed on an Agilent XDB C18 column with mobile phase consisted of water-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.2 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was set at 210 nm. The sample size was 10 μL. RESULTS： The purity of rotundic acid exceeded 99%. The linear ranges of syringing， peduncloside and rotundic acid were 0.18-3.22， 0.59-10.36 and 0.20-3.53 μg， respectively （r=0.999 9）. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6-7）. The average recoveries were 96.08%-100.81%（RSD≤1.98%，n=6）. The contents of syringoside， peduncloside and rotundic acid in I. rotundae were 1.61%， 7.26%， 1.29% （RSD≤1.08%， n=3）； those of refined product 1 were 0， 82.59%， 4.18% （RSD≤1.67%， n=3）； those of refined product 2 were 0， 73.29%， 7.41% （RSD≤1.15%，n=3）， respectively. CONCLUSIONS： Prepared rotundic acid has high purity and is simple in preparation， safe and environmentally-friendly. RP-HPLC method that established is simple and reliable， and can meet the requirements for rapid analysis of I. rotundae and its refined products.

KEYWORDS Ilicis rotundae； Syringoside； Peduncloside； Rotundic acid； Preparation； RP-HPLC

救必應(yīng)（Ilicis rotundae Cortex）為冬青科植物鐵冬青（Ilex rotunda Thunb）的干燥樹(shù)皮，收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，救必應(yīng)藥材中的活性成分分別為紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸，在治療心血管疾病[2-4]、抗腫瘤[5-7]、消腫止痛[8-10]等方面具有明顯作用。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中，從救必應(yīng)藥材中采用水解和柱層析法精制得到救必應(yīng)酸，總收率約為5%[6]。另在分析研究中，已報(bào)道的采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定救必應(yīng)藥材中紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸、丁香脂素4′ -O-β-D-吡喃葡萄糖苷4種成分的含量的方法分析時(shí)間較長(zhǎng)，救必應(yīng)酸的出峰時(shí)間在40 min后，且流動(dòng)相中的無(wú)機(jī)酸可能造成救必應(yīng)苷的水解而影響含量測(cè)定準(zhǔn)確性[11-12]。文獻(xiàn)中純化救必應(yīng)酸過(guò)程采用硅膠分離方法，操作較為煩瑣，展開(kāi)劑使用量大[6]。本研究改善制備工藝以制備救必應(yīng)酸單體，并進(jìn)一步優(yōu)化含量測(cè)定的HPLC條件，為藥材及精制品中紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量測(cè)定提供更準(zhǔn)確、快速的評(píng)價(jià)方法。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；SB-3200DT型超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TP-114型電子天平[丹佛儀器（北京）有限公司]；Quattro Micro API型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；600 MHz Advance型核磁共振（NMR）波譜儀（德國(guó)Bruker公司）。

1.2 藥材與試劑

救必應(yīng)藥材（廣州清平藥材市場(chǎng)，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院蘇薇薇教授鑒定為冬青科植物鐵冬青Ilex rotunda Thunb.的干燥樹(shù)皮，密封干燥常溫保存）；紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)：111574-201504，純度：94.9%）、長(zhǎng)梗冬青苷對(duì)照品（批號(hào)：11868-201001，純度：89.3%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；救必應(yīng)酸為華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院醫(yī)藥生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制（面積歸一化法檢測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%）；采用甲醇溶劑降溫重結(jié)晶方法代替文獻(xiàn)[6]中的硅膠柱層析方法得到救必應(yīng)精制品1；采用甲醇飽和溶液加水析晶方法代替文獻(xiàn)[6]中的硅膠柱層析方法得到救必應(yīng)精制品2（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院醫(yī)藥生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制）；乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司）；水為超純水；其余試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1 救必應(yīng)酸的制備及結(jié)構(gòu)確證

按文獻(xiàn)[6]的提取工藝得到救必應(yīng)皂苷。將10.0 g救必應(yīng)皂苷先后溶解于20 mL 甲醇和100 mL的2 mol/L 的氫氧化鈉溶液中，回流反應(yīng)2 h。然后用鹽酸酸化反應(yīng)液，靜置過(guò)濾。向?yàn)V渣中加入30 mL水和10 mL乙醇，在50 ℃下重結(jié)晶2次，干燥得救必應(yīng)酸。采用Quattro Micro API型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀和600 MHz Advance型 NMR波譜儀確證救必應(yīng)酸的結(jié)構(gòu)，并測(cè)定其純度。救必應(yīng)酸的高分辨質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）顯示準(zhǔn)分子離子峰，其質(zhì)荷比m/z為511.340 5（[M+Na]+，理論值為511.341 2），純化產(chǎn)物核磁共振氫譜（1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-NMR）核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)對(duì)照一致[13]。經(jīng)面積歸一化法得出自制救必應(yīng)酸純度達(dá)99.0%。本研究采用重結(jié)晶方法代替文獻(xiàn)[6]中硅膠分離法，操作更簡(jiǎn)單，同時(shí)還能減少展開(kāi)劑使用。同時(shí)救必應(yīng)酸單體在甲醇中溶解度大，向甲醇溶液中加水后會(huì)析出救必應(yīng)酸，方便純化。另外，采用17%甲醇回流，相比較文獻(xiàn)30%乙醇，有機(jī)溶劑使用量減少，符合環(huán)保的要求。

2.2 反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 取紫丁香苷對(duì)照品、長(zhǎng)梗冬青苷對(duì)照品、救必應(yīng)酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇配制成含紫丁香苷0.09 mg/mL、長(zhǎng)梗冬青苷0.30 mg/mL、救必應(yīng)酸0.10 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備[1] 取適量干燥的救必應(yīng)藥材粉碎，過(guò)3號(hào)篩。精密稱(chēng)定0.1 g粉末，加入甲醇25 mL，超聲（功率：180 W，頻率：40 kHz）提取 30 min，待冷卻后用甲醇補(bǔ)充超聲前后的差量，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 色譜柱：Agilent XDB C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，10%～12%B；5～20 min，12%～50%B；20～30 min，50%B）；流速：1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取“2.2.1” “2.2.2”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果顯示，其他成分對(duì)紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的測(cè)定無(wú)干擾。理論板數(shù)以3種待測(cè)成分計(jì)均大于3 000，且紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸與相鄰峰分離度均大于1.5。對(duì)照品和供試品的色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別吸取2、5、10、15、20、25、30、35 μL混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的回歸方程分別為y=1 606.92x+53.85、y=172.44x+0.52、y=248.21 x-1.97（r均為 0.999 9）。結(jié)果表明，紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.18～3.22、0.59～10.36、0.20～3.53 μg。

2.2.5 定量限與檢測(cè)限考察 將對(duì)照品溶液逐步稀釋?zhuān)M(jìn)樣。在信噪比為10時(shí)測(cè)定紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的定量限分別為14.2、95.0、176.9 ng，在信噪比為3時(shí)測(cè)得3種物質(zhì)的檢測(cè)限分別為4.1、49.4、67.3 ng。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 重復(fù)進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液6次，記錄3種成分的峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果，紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸峰面積RSD分別為1.22%、0.63%、0.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)量6份藥材粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定3種成分的量。結(jié)果，紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為1.61%、7.24%、1.30%（n=6），對(duì)應(yīng)RSD分別為0.83%、1.54%、1.97%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液室溫放置。分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量的RSD分別為0.47%、0.96%、0.41%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 平行稱(chēng)量6份已知含量的救必應(yīng)藥材0.1 g，根據(jù)救必應(yīng)藥材中3種成分的含量分別加入一定量的單個(gè)對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液。進(jìn)樣測(cè)定3種成分的含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的平均加樣回收率分別為98.90%、100.81%、96.08%（n=6），RSD分別為1.72%、1.55%、1.98%（n=6），表明本法測(cè)定準(zhǔn)確度良好，符合含量測(cè)定要求。

2.2.10 樣品測(cè)定 取救必應(yīng)藥材、精制品1和精制品2制備的供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各樣品中紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的量，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，救必應(yīng)藥材中紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量分別為1.61%、7.26%、1.29%。與救必應(yīng)藥材比較，精制品1和精制品2中均未檢測(cè)到紫丁香苷成分，長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸因精制工藝不同而含量不同。

3 討論

本研究?jī)?yōu)化了救必應(yīng)酸提取純化方法和3種成分含量測(cè)定的RP-HPLC方法，采用重結(jié)晶方法代替普通硅膠柱分離救必應(yīng)酸成分，減少展開(kāi)劑使用，工藝更簡(jiǎn)單；回流提取過(guò)程采用17%甲醇代替30%乙醇。本研究是通過(guò)救必應(yīng)提取純化制備救必應(yīng)酸單體作為研究對(duì)象，意在開(kāi)發(fā)救必應(yīng)酸這一單體藥物（化學(xué)1.1類(lèi)新藥），提取工藝研究中使用的甲醇。將在后續(xù)制備產(chǎn)品過(guò)程中檢查甲醇?xì)埩袅浚怪蠂?guó)家規(guī)范。救必應(yīng)酸制備過(guò)程中篩選了不同的提取溶液。救必應(yīng)酸在甲醇中溶解度大，且在后續(xù)處理過(guò)程中在加入水后會(huì)析出救必應(yīng)酸，方便純化救必應(yīng)酸單體。另甲醇基本可以100%回收利用，符合環(huán)保的要求，故在制備中選用甲醇為提取液。

為改善色譜峰形狀，文獻(xiàn)[12]中采用了加入無(wú)機(jī)酸的方法。本文建立的RP-HPLC方法則將文獻(xiàn)中流速1.0 mL/min提高為1.2 mL/min，既能起到改善峰形作用，又能縮短分析時(shí)間，所有成分可在30 min內(nèi)完成含量測(cè)定。

采用精制工藝獲得的救必應(yīng)精制品作為純化救必應(yīng)酸的原料，在精制過(guò)程中通過(guò)堿水解、抗溶劑化結(jié)晶方法去除紫丁香苷成分，所以精制品中紫丁香苷成分含量為0。雖然長(zhǎng)梗冬青苷和救必應(yīng)酸的含量因精制工藝而明顯不同，但是工藝穩(wěn)定性很好。大多數(shù)研究多以紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷兩種成分的含量評(píng)價(jià)救必應(yīng)藥材及其制劑的質(zhì)量[1，14-15]。救必應(yīng)酸作為藥材中治療心血管疾病的活性成分，且為長(zhǎng)梗冬青苷在體內(nèi)的水解產(chǎn)物，因此也應(yīng)控制其在救必應(yīng)藥材及其制劑中的含量。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定救必應(yīng)藥材中紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷含量不得少于1.0%、4.5%，并未規(guī)定救必應(yīng)酸的含量。不同產(chǎn)地救必應(yīng)藥材中救必應(yīng)酸的含量差別大，所以設(shè)定藥材和制劑中救必應(yīng)酸含量的最低限度還需大量測(cè)定不同產(chǎn)地救必應(yīng)藥材，并依據(jù)藥材或制劑的藥效確定。本研究建立的RP-HPLC法滿足同時(shí)測(cè)定紫丁香苷、長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸含量的需要，方法快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為救必應(yīng)藥材和制劑的質(zhì)量控制提供了科學(xué)的依據(jù)。

本試驗(yàn)尚未比較經(jīng)不同的提取精制工藝后長(zhǎng)梗冬青苷、救必應(yīng)酸的含量變化，下一步計(jì)劃設(shè)計(jì)多種工藝比較二者的含量差異；另外，計(jì)劃通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)探討救必應(yīng)酸單體在治療心血管疾病方面的活性，為開(kāi)發(fā)救必應(yīng)酸單體藥物奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-04-05 修回日期：2017-11-30）

（編輯：余慶華）