金釵石斛葉中總黃酮的提取分離及體外抗阿爾茨海默病活性研究

李艷萍　李海燕　紀曉婉　岑志芳　顏金武　吳劍峰

中圖分類號 R961 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0330-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.10

摘 要 目的：對金釵石斛葉中總黃酮進行提取分離，并考察其體外抗阿爾茨海默病（AD）活性。方法：采用超聲提取法提取金釵石斛葉中總黃酮，將所得浸膏用水分散后分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，采用顯色反應和薄層色譜法對各極性提取物進行定性分析，硝酸鋁-亞硝酸鈉法定量分析各提取物中總黃酮含量。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試驗考察各提取物的體外抗氧化活性，硫黃素T法考察各提取物對Aβ42蛋白聚集的抑制作用，紫外-可見光譜掃描法測定各提取物對金屬離子（Cu2+，Fe3+和Zn2+）的螯合能力，以考察其體外抗AD活性。結果：乙酸乙酯、正丁醇、水提取物中均含有黃酮成分，含量分別為0.03、0.12、0.05 mg/mL。3種提取液對DPPH自由基的半數清除濃度（IC50）分別為0.021、0.011、0.013 mg/mL，對Aβ42蛋白聚集的抑制率分別為43.77%、52.28%、38.42%，對金屬離子具有一定的螯合能力，其中尤以對Cu2+的螯合作用最為明顯。結論：金釵石斛葉中總黃酮具有較好的抗氧化、抑制Aβ42蛋白聚集及螯合金屬離子的能力，具有一定的體外抗AD活性，且以正丁醇提取物效果最明顯。

關鍵詞 金釵石斛葉；黃酮成分；阿爾茨海默病；抗氧化；Aβ42蛋白

ABSTRACT OBJECTIVE： To separate and isolate total flavonoids from Dendrobium nobile leaves， and to investigate its anti-Alzheimers disease （AD） activity in vitro. METHODS： Total flavonoids were obtained by ultrasonic extraction method and extracted by chloroform， ethyl acetate and butyl alcohol after the obtained extract was dispersed with water. Qualitative analysis was carried out with color reaction and TLC. The content of total flavonoids in extracts was analyzed quantitatively by Aluminum nitrate-sodium nitrite method. Antioxidant activity of extract was investigated by DPPH radical scavenging assay； the inhibitory effect of each extract on Aβ42 protein aggregation was investigated by Thioflavin T assay. Metals （Cu2+， Fe3+， Zn2+） chelating property was studied by UV-vis spectrum scanning to investigate the anti-AD activity in vitro. RESULTS： The flavonoids were found in ethyl acetate， butyl alcohol and aqueous extracts， and their flavonoids contents were 0.03， 0.12， 0.05 mg/mL， respectively. IC50 of three extracts to DPPH free radicals were 0.021， 0.011， 0.013 mg/mL. Inhibitory rates of them to Aβ42 protein aggregation were 43.77%， 52.28%， 38.42%， respectively. Three extracts exerted metal chelating ability which was best in Cu2+. CONCLUSIONS： The total flavonoids from D. nobile leaves have good antioxidant activities， Aβ42 aggregation inhibitory activities and metal chelating activity， show certain anti-AD activity in vitro especially in butyl alcohol extract.

KEYWORDS Dendrobium nobile leaves； Flavonoids； Alzheimers disease； Antioxidant； Aβ42 protein

金釵石斛（Dendrobium nobile）作為我國傳統名貴中藥，為蘭科石斛屬植物，始載于《神農本草經》，被列為上品，主要以新鮮或干燥莖入藥[1]，是2015年版《中國藥典》（一部）中藥用石斛的首要來源。一直以來，人們主要對其莖部開展相關化學成分和藥理作用研究，發現有效成分主要是石斛堿和多糖類物質，藥理活性主要有增強免疫力和抗腫瘤等。至今，對金釵石斛葉和花部位的研究很少。

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種神經退行性疾病，其發病率占老年性癡呆的60%～80%，目前AD尚無有效的治療藥物[2]。由于AD的病理特征復雜，多靶點抗AD研究已成為抗AD藥物研發的熱門方向，其主要靶點包括膽堿酯酶、Aβ蛋白、自由基以及金屬離子等[3]。黃酮是一類天然抗氧化劑，具有抗氧化、降血糖和保護心血管等作用。近年來，多種黃酮類物質被發現具有良好的抗AD活性。有研究指出，日常飲食中攝入一定量的黃酮成分有助于AD的治療[4]。相比莖部來說，金釵石斛葉中黃酮類成分含量更高[5]。本研究擬通過提取分離手段獲得金釵石斛葉中總黃酮，并對其進行初步的體外抗AD活性評價，為金釵石斛葉這一資源的開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BS-110S電子分析天平（德國賽多利斯公司）；RE52-99旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；硅膠G板（德國Merck公司）；TLC Visualizer薄層色譜數碼成像系統（瑞士CAMAG公司）；UV-1600 PC紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；WFY-28熒光分光光度計（天津市拓普儀器有限公司）；RT-6100酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.2 藥材與試劑

金釵石斛葉（廣東國方醫藥有限公司，批號：2016-05-28，經佛山科學技術學院李海燕副教授鑒定為真品）；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707，純度：99.0%）；Aβ42蛋白（上海強耀生物有限公司，批號：2016-01-20，純度：>95%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、姜黃素、硫磺素T（美國Sigma-Aldrich公司，批號：101585784、1002008101、1002- 142019，純度：>97%、>98%、60%～75%）；水溶性維生素E（Trolox，上海阿拉丁生物科技有限公司）；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇（天津市富宇精細化工有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 金釵石斛葉中總黃酮的提取

將新鮮金釵石斛葉清洗、烘干至恒質量，研碎成粉末。精確稱取粉末4 g，用濾紙包好放入索氏提取器中，加入140 mL石油醚回流脫脂[6]，虹吸至提取液接近無色。取出濾渣，置于錐形瓶中，加80%乙醇室溫下超聲提取，每次35 min，直至提取液顏色接近無色。合并提取液，于旋轉蒸發儀旋干溶液，得浸膏。將浸膏懸浮于水，分別用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑連續萃取至無色，合并相同溶劑的萃取液，分別減壓濃縮后得到4種提取物。然后將4種提取物分別用80%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中，得到氯仿提取物溶液（A溶液）、乙酸乙酯提取物溶液（B溶液）、正丁醇提取物溶液（C溶液）和水提取物溶液（D溶液）。

2.2 黃酮成分的定性分析

2.2.1 顯色反應法 分別采用鹽酸-鎂粉反應法、堿性試劑顯色反應法、鋁鹽反應法、醛糖形成反應（Molish反應）和三氯化鐵反應法[7]定性分析4種提取物溶液中含黃酮成分情況。結果，A溶液在鹽酸-鎂粉反應和三氯化鐵反應中顯色不明顯，在堿性試劑顯色反應和鋁鹽反應中呈陰性，僅在Molish反應中呈陽性；而B、C、D溶液在5種顯色反應中均呈陽性。結果提示，B、C、D溶液中含有黃酮成分。

2.2.2 薄層色譜法 取A、B、C、D溶液點樣在硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V，下同）為展開劑展開后，取出，自然晾干，噴1% AlCl3溶液[8]，揮干后在薄層色譜數碼成像中觀察斑點情況。結果，B、C、D溶液中均有出現條帶，而A溶液中沒有。結合顯色反應與薄層色譜結果，表明除了A溶液，其余3種提取液中均存在黃酮類成分。薄層色譜圖見圖1。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品0.010 1 g，用80%乙醇定容至50 mL量瓶中，搖勻，得對照品溶液。精密量取對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL量瓶中，不足5 mL的加80%乙醇補足5 mL；精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；然后加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，最后用80%乙醇定容，搖勻，放置15 min[9-10]。在510 nm波長處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標（y）、蘆丁質量濃度為橫坐標（x）作標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程y=13.526x-0.013 95（R2=0.998 8）。結果表明，蘆丁檢測質量濃度線性范圍為0.02～0.10 mg/mL。

2.3.2 含量測定 精密量取B、C、D溶液各2 mL于10 mL量瓶中，按“2.3.1”項下方法進行測定，并由回歸方程計算各樣品中總黃酮含量。結果，B、C、D溶液中總黃酮含量分別為0.03、0.12、0.05 mg/mL，折算成每克葉中的含量分別為0.38、1.57、0.63 mg/g。從結果可知，各提取物中總黃酮含量大小順序為C溶液>D溶液>B溶液。

2.4 DPPH自由基清除能力

2.4.1 溶液的制備 （1）DPPH溶液：稱取0.001 1 g的DPPH，用80%乙醇溶解并定容于25 mL量瓶中，搖勻，得濃度為100 μmol/L的溶液，保存于冰箱中，備用[11-12]。（2）Trolox溶液：稱取0.009 7 g 的Trolox，用無水乙醇溶解并定容于5 mL 量瓶中，搖勻。然后稀釋至80、60、40、20 μmol/L，備用。（3）樣品溶液：精密量取B溶液250、200、150、100、50、20 μL，C溶液150、125、100、75、50、25 μL，D溶液225、200、175、150、125、100 μL，分別置于離心管中，再分別加入80%乙醇補足體積至500 μL。

2.4.2 DPPH自由基清除試驗 量取以上稀釋好的Trolox溶液和B、C、D樣品液各100 μL，再加入100 μL的DPPH溶液。空白溶液為80%乙醇，陰性對照為100 μL的80%乙醇與100 μL的DPPH溶液的混合液。充分混合后，室溫避光放置50 min，然后用酶標分析儀于517 nm波長處測定其吸光度（A），所有樣品均重復3次。計算DPPH自由基清除率。清除率（%）=[（A對-A空）- （A樣-A空）]/（A對-A空），式中，A對為陰性對照的A，A樣為樣品溶液與DPPH反應后的A，A空為空白溶液的A。根據清除率與各樣品濃度的擬合曲線計算其半數清除濃度（IC50）。結果表明，對照品Trolox對 DPPH自由基的IC50為28.85 μmol/L（0.007 mg/mL），B、C、D溶液對DPPH自由基的IC50分別為0.021、0.011、0.013 mg/mL。

2.5 Aβ42蛋白聚集抑制活性

精密稱取Aβ42蛋白0.2 mg，用1%NH3·H2O溶液100 μL溶解，然后用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至20 μmol/L。取B、C、D溶液各150 μL，分別加入150 μL的Aβ42蛋白溶液作為樣品溶液，陰性對照為150 μL的 Aβ42蛋白溶液與150 μL磷酸鹽緩沖液，陽性對照為20 μmol/L的姜黃素溶液。樣品空白分別為B、C、D溶液以及姜黃素溶液各150 μL與150 μL緩沖溶液的混合液，背景空白為300 μL的緩沖溶液與2 700 μL的硫磺素T溶液的混合液。將上述溶液混勻后，在37 ℃條件下反應72 h，然后分別加入2 700 μL的硫磺素T溶液（5 μmol/L，用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制），混勻，反應2 min。最后測試熒光吸收值，其中激發波長為450 nm、發射波長為482 nm[13]。每個樣品均重復3次，計算Aβ42蛋白聚集抑制率[Aβ42蛋白聚集抑制率（%）=（1-IFi/IFc）×100%。式中，IFi指樣品扣除樣品空白后的熒光吸收值，IFc指陰性對照扣除背景空白后的熒光吸收值]。結果顯示，對照品姜黃素的Aβ42蛋白聚集抑制率為50.35%，B、C、D溶液的Aβ42蛋白聚集抑制率分別為43.77%、52.28%、38.42%。結果提示，B、C、D溶液對Aβ42蛋白聚集均有較好的抑制活性，其中活性大小順序為C溶液>B溶液>D溶液。

2.6 金屬離子螯合能力

稱取0.002 5 g的CuSO4·5H2O、0.002 7 g的FeCl3·6H2O和0.002 9 g的ZnSO4·7H2O，分別用80%乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制備濃度均為1 mmol/L的Cu2+、Fe3+和Zn2+溶液。精密量取B、C、D溶液各1 mL，置于不同EP管中，加入80%乙醇溶液4 mL進行稀釋，搖勻。各取3份上述稀釋液1 mL置于試管中，分別加入Cu2+溶液200 μL、Fe3+溶液200 μL和Zn2+溶液400 μL，然后用80%乙醇溶液稀釋至4 mL。參比溶液為以80%乙醇為溶劑的等濃度同種離子溶液[13]。混勻后室溫放置30 min[14]。常溫下用紫外-可見分光光度計進行掃描，波長范圍為200～500 nm，波長間隔為1 nm，掃描速率為200 nm/min。各溶液對金屬離子螯合能力測定結果見圖2。

由圖2可知，B、C、D溶液與Cu2+、Fe3+和Zn2+作用后吸收光譜均出現一定的變化，其中與Cu2+作用后吸光譜改變最為明顯。可知，這3種溶液對Cu2+、Fe3+、Zn2+等金屬離子均表現出一定的螯合能力，且以對Cu2+螯合能力最強。

3 討論

3.1 總黃酮的提取與分離方法

本文在提取總黃酮前，先用石油醚進行脫脂，以便除去葉綠素等脂溶性色素，減少對顯色反應和其他試驗結果的影響。另外，本文曾對比回流法與超聲法的提取效率[15]，發現后者提取效率是前者的3倍多，因此采用后者作為總黃酮的提取方法。本研究的萃取試劑選用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇這3種不同極性的溶劑，目的是分離不同極性的黃酮類成分，獲得黃酮苷與苷元。在萃取過程中，正丁醇與水層之間容易出現乳化，加大正丁醇和水層之間的比例或者靜置過夜可有效減少乳化現象。

3.2 金釵石斛葉中黃酮成分的性質

在薄層色譜試驗中，筆者曾嘗試以正丁醇-醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5）、正丁醇-醋酸-水（6 ∶ 1 ∶ 5）、甲醇-水（1 ∶ 1）、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（50 ∶ 5 ∶ 10 ∶ 1）、氯仿-甲醇-水（4 ∶ 1 ∶ 0.1）、氯仿-甲醇-甲酸（15 ∶ 5 ∶ 1）等為展開劑，發現以正丁醇- 醋酸-水（4 ∶ 1 ∶ 5）分離效果最好，斑點清晰，故最終采用此條件。定性試驗結果表明，乙酸乙酯、正丁醇和水提取物中均存在黃酮類成分，而氯仿提取物中則沒有，并且黃酮含量大小順序為正丁醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物。這表明金釵石斛葉中黃酮類物質的極性較大，并且極性大的成分含量比較高，可能主要以黃酮苷的形式存在。目前鮮有金釵石斛葉中黃酮化學成分的報道，這一研究結果對于筆者后續進行黃酮單體成分的分離具有重要的指導意義。

3.3 金釵石斛葉中黃酮成分的體外抗AD活性

本研究初步考察了金釵石斛葉中黃酮成分對AD的靶點——Aβ42蛋白、自由基以及金屬離子的影響。其中，Aβ42蛋白是AD患者腦部淀粉樣斑塊的主要成分，是一個大約4.2 kDa的短肽，Aβ42蛋白的聚集是其產生神經毒性的前提。自由基的產生和清除失衡會導致細胞中DNA、脂質、多糖和蛋白質過度損傷，是引發AD患者神經元功能障礙的重要原因[16]。在AD患者腦部，金屬離子Cu2+、Fe3+、Zn2+的濃度異常升高，這些金屬離子可以與Aβ42蛋白結合而促進其聚集，并且能夠催化活性氧的產生，導致氧化應激反應[17]。因此，抑制Aβ42蛋白的聚集、清除自由基以及金屬離子將有利于AD的治療。結合含量測定和活性研究結果可以看出，含有黃酮成分的乙酸乙酯、正丁醇和水提取物在抗氧化、抑制Aβ42蛋白聚集和螯合金屬離子方面均表現出良好的活性，并且活性大小順序基本與黃酮含量大小順序一致。其中正丁醇提取物中黃酮成分的含量最高，活性也最好，值得進行下一步的單體成分的分離研究。

目前國內外對金釵石斛葉中黃酮類化合物研究較少，本研究分離獲得了金釵石斛葉中的黃酮成分，并發現其在抗AD方面具有良好的活性，值得進行深入研究，而本研究結果可以為更好地開發利用金釵石斛葉這一資源提供基礎研究數據。

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（收稿日期：2017-08-14 修回日期：2017-11-13）

（編輯：林 靜）