基于三黃瀉心湯的黃芩—大黃—黃連不同劑量配伍對黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響

鄧麗紅　謝臻　陳勇　李耀華　龐婷

中圖分類號 R284；R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0334-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.11

摘 要 目的：基于三黃瀉心湯（簡稱“瀉心湯”）考察黃芩-大黃-黃連不同劑量配伍對黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響，為研究中藥復方藥味劑量組成配伍的化學機制提供參考。方法：以高效液相色譜法測定黃芩苷、漢黃芩苷含量。固定黃芩劑量（3 g）不變，以大黃和黃連的不同劑量為因素，黃芩苷和漢黃芩苷的溶出率為響應值，設計二因素五水平星點試驗，采用響應面法優化黃芩-大黃-黃連最佳劑量配伍，并與經典劑量瀉心湯（黃芩3 g、大黃6 g、黃連3 g）比較其中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率的變化。結果：黃芩、大黃、黃連的劑量分別為3、1.76、0.17 g時提取液中黃芩苷和漢黃芩苷的總溶出率最高，驗證試驗中黃芩苷和漢黃芩苷的總溶出率平均為21.89%（RSD=0.46%，n=3），與預測值22.54%的相對誤差為2.88%；與經典劑量瀉心湯比較，最優配伍劑量黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷總溶出率提高了47.21%。結論：基于瀉心湯的黃芩-大黃-黃連不同劑量配伍對黃芩苷和漢黃芩苷溶出有一定影響，當黃芩、大黃、黃連的劑量分別為3、1.76、0.17 g時其溶出率高于經典劑量。

關鍵詞 三黃瀉心湯；黃芩苷；漢黃芩苷；劑量配伍；星點設計；響應面法；溶出率

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of different dose compatibility of Scutellaria baicalensis-Rheum palmatum- Coptis chinensis based on Sanhuang Xiexin decoction （shorted for Xiexin decoction） on dissolution rate of baicalin and baicalein， and to provide reference for studying chemical mechanism of TCM compound dose composition compatibility. METHODS： HPLC method was used to determine the contents of baicalin and baicalein. By fixing the dose of S. baicalensis （3 g）， using the dose of R. palmatum and C. chinensis as factors， dissolution rate of baicalin and baicalein as response value， two-factor and five-level central composite test was designed. The optimal dose compatibility of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis was optimized by response surface method， and compared with the dissolution rate of baicalin and baicalein in classic dose Xiexin decoction （S. baicalensis 3 g， R. Palmatum 6 g， C. chinensis 3 g）. RESULTS： When the doses of S. baicalensis， R. palmatum， C. chinensis were 3， 1.76， 0.17 g， total dissolution rate of baicalin and baicalein was the highest in extract. The average total dissolution rate of baicalin and baicalein in validation test was 21.89% （RSD=0.46%， n=3）， and the relative error was 2.88% with the predicted value of 22.54%. Compared with the classical dose of Xiexin decoction， the total dissolution rate of baicalin and baicalein in the optimum dose of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis in extract was increased by 47.21%. CONCLUSIONS： The different dose compatibility of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis based on Xiexin decoction influence the dissolution of baicalin and baicalein to certain extent. When the doses of S. baicalensis， R. palmatum， C. chinensis are 3， 1.76， 0.17 g， dissolution rate of baicalin and baicalein are higher than that of classic dose.

KEYWORDS Sanhuang Xiexin decoction； Baicalin； Baicalein； Dose compatibility； Central composite design； Response surface methodology； Dissolution rate

三黃瀉心湯（后文簡稱“瀉心湯”）出自《金匱要略》，其藥物組成為大黃二兩（6 g）、黃連一兩（3 g）、黃芩一兩（3 g），水煎后服用，具有清心瀉火、涼血止血的功效，主治心火內盛、迫血妄行及癥見吐血衄血、便秘溲赤者[1]。現代臨床應用顯示，瀉心湯適應證較廣泛，且臨床療效較好[2-4]。蒽醌類、黃酮類和生物堿類成分是瀉心湯中的主要活性成分[5]，同時也是多種中草藥的有效成分。文獻報道，黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抑菌、調節心血管等藥理作用[6-10]，而黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩苷等黃酮成分[11]。瀉心湯的經典劑量比例為大黃-黃芩-黃連（2 ∶ 1 ∶ 1）。目前，對本方的藥理作用研究較多，但是對瀉心湯中黃芩-大黃-黃連不同劑量配伍是否會引起其中黃芩苷和漢黃芩苷的溶出變化還未可知。許多學者利用數學方法進行化學成分變化規律的研究，如均勻設計法、正交設計法、偏最小二乘法等[12]，與均勻設計法、正交設計法比較，星點設計法具有試驗次數較少、精度較高等優點[13]。故本研究以黃芩苷和漢黃芩苷溶出率為響應值，采用星點設計-響應面法優化黃芩-大黃-黃連的最佳劑量配伍，為研究中藥復方藥味劑量組成配伍的化學機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀，包括2998PDA檢測器、四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、Empower3工作站（美國沃特世科技有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；FW17型中草藥打粉機（天津泰斯特儀器設備有限公司）；HWS24型電熱恒溫數顯水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

中藥飲片大黃、黃連、黃芩（廣州康美藥業股份有限公司，批號：161008891、161106631、161105141）；黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品（上海融禾醫藥科技有限公司，批號：160624、160711，純度：均≥98%）；甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（流動相A）-0.2%磷酸水溶液（流動相B），梯度洗脫（0～10 min，45%A；10～55 min，45% A～70%A；55～56 min，70%A～45%A）；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：5 μL。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液的制備。精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷對照品適量 ，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作為貯備液。分別精密移取一定量的上述貯備液至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，分別制成每1 mL溶液中含黃芩苷 0. 050 22 mg、漢黃芩苷0.008 08 mg的混合對照品溶液，然后以離心半徑為16 cm、13 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

（2）不同劑量配伍黃芩-大黃-黃連提取液的制備。精密稱定黃芩藥材粉末3 g，按表2星點設計試驗，精密稱定相應量大黃、黃連粉末，置于圓底燒瓶中，加入30倍量水，稱質量；浸泡30 min，加熱回流提取20 min，放冷；補足減失的質量，濾過，得瀉心湯提取液。

（3）供試品溶液的制備。精密移取“2.1.2（2）”項下提取液（按方案9制備）1 mL，轉移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，以離心半徑為16 cm、13 000 r/min離心10 min ，取上清液，得供試品溶液。

（4）缺黃芩陰性樣品溶液的制備。按“2.1.2（2）”項下劑量精密稱定大黃、黃連粉末并進行相應處理后，得到缺黃芩的提取液，精密移取缺黃芩的提取液1 mL，按“2.1.2（3）”項下方法操作得缺黃芩陰性樣品溶液。

2.1.3 方法學考察 （1）專屬性試驗。分別取混合對照品溶液、供試品溶液和缺黃芩陰性樣品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，其他組分不干擾黃芩苷和漢黃芩苷的測定，分離度均大于1.5，方法專屬性和選擇性好，色譜圖見圖1。

（2）線性關系考察。分別取“2.1.2（1）”項下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。以混合對照品進樣量 （x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得黃芩苷回歸方程為y=3×106x-123 389（r=0.999 9），檢測進樣量線性范圍為0.100 44～0.703 08 μg；漢黃芩苷回歸方程為y=4×106x-325 13（r=0.999 9），檢測進樣量線性范圍為0.016 16～0.113 12 μg。

（3）精密度試驗。取“2.1.2（3）”項下同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，重復進樣6次。結果，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（4）穩定性試驗。取“2.1.2（3）”項下同一供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，24 h內，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（5）重復性試驗。精密移取“2.1.2（2）”項下同一瀉心湯提取液1 mL，共6份，按“2.1.2（3）”項下方法制備成供試品溶液，然后按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（6）準確度試驗。精密移取“2.1.2（2）”項下同一瀉心湯提取液0.5 mL ，共6份，分別精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.1.2（3）”項下方法制備溶液，然后按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果，黃芩苷、漢黃芩苷平均加樣回收率分別為99.66%、99.57%，RSD值均小于2.0%（n=6）。

2.2 星點設計-響應面法優化黃芩-大黃-黃連劑量配伍

2.2.1 星點設計 因瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷來自黃芩，故固定黃芩的劑量不變（均為3 g），以大黃（X1）、黃連（X2）的量為考察因素，以黃芩苷、漢黃芩苷溶出率之和（Y）為指標（響應值），采用星點試驗法設計黃芩-大黃-黃連的配伍劑量[14]。因素與水平見表1，星點設計試驗結果見表2。

2.2.2 模型擬合 以大黃（X1）、黃連（X2）的量為自變量，以Y值為因變量，對試驗結果進行多元線性回歸和二項式擬合，以方程的P<0.05作為顯著標準，選擇有較大r值的模型，得多元線性方程為Y=19.945 19+0.5579 2X1- 2.893 49X2（r=0.982 7，P<0.05）；擬合的二項式方程為Y=23.137 20-3.672 07X2-0.013 09X12-0.106 55X22+0.236 43X1X2（r=0.997 0，P<0.05），復相關系數r=0.997 0，相對多元線性擬合有提高，表明該方程有較大的可信度，預測性較好。簡化的二項式擬合結果見表3。

由表3可知，一次項X2、二次項X22、交互項X1X2對黃芩苷和漢黃芩苷溶出率均有顯著影響（P<0.05），特別是X2項影響最為顯著，提示黃連的量的微小變化即對黃芩苷和漢黃芩苷的溶出有較大影響。

2.2.3 響應面法優化黃芩-大黃-黃連劑量配伍 大黃與黃連的量對黃芪類成分溶出有交互作用。固定黃芩和大黃的量不變時，增大黃連的量，Y值降低；固定黃芩和黃連的量不變，增大大黃的量，Y值有較小幅度的增大，見圖2。

應用LINGO 9.0軟件求導后可得：當黃芩的量為3 g、大黃的量為1.76 g、黃連的量為0.17 g 時，有最大Y值22.54%。故本試驗最終選取黃芩-大黃-黃連的最優劑量配伍為黃芩3 g、大黃1.76 g、黃連0.17 g。

2.2.4 驗證試驗 根據最優劑量比例提取黃芩-大黃-黃連溶液3份，按照前述方法測定其中黃芩苷和漢黃芩苷的溶出率。結果所制3份黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷平均總溶出率為21.89%，與預測值22.54%的相對誤差為2.88%（n=3），可見預測性較好。

2.3 最優配伍劑量黃芩-大黃-黃連提取液與經典劑量瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率比較

分別按黃芩-大黃-黃連最佳劑量配伍（黃芩3 g、大黃1.76 g、黃連0.17 g）和經典劑量比例（大黃6 g、黃連3 g、黃芩3 g）瀉心湯制備提取液，按前述方法處理并測定其中黃芩苷與漢黃芩苷的總溶出率（兩種劑量的總溶出率分別用Y1、Y2表示），并計算最優配伍劑量黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率的增加率（%）[（│Y2-Y1│）/Y2×100%]，結果見表4。

表4 最優配伍劑量黃芩-大黃-黃連與經典劑量瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率比較結果（%）

Tab 4 Comparison of dissolution rate of baicalin and baicalein in optimal dose of S. baicalensis- R. palmatum-C. chinensis and classic dose of Xiexin decoction（%）

[試驗號 Y1 Y2 增加率 1 21.98 14.84 48.11 2 21.91 14.79 48.14 3 21.78 14.97 45.80 平均值 21.89 14.87 47.21 ]

3 討論

固定黃芩的劑量不變，只改變其他2味中藥的劑量，是考慮到瀉心湯中的黃芩苷和漢黃芩苷來自黃芩，固定黃芩在整方中的量不變，更便于比較大黃、黃連量的變化對瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響。本研究應用星點設計-響應面法優化不同劑量配伍黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷溶出變化，本次建立的二項式擬合模型是科學、合理、有效的，建立的方程能夠較好地預測黃芩苷、漢黃芩苷的總溶出率，具有現實指導意義。本研究結果顯示，大黃劑量的變化對黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響相對于黃連小，可能是酸性成分之間（即大黃中酸性成分與黃芩中黃酮酸性成分）相互作用弱于酸性、堿性成分之間（即黃芩中黃酮酸性成分和黃連中堿性成分）的相互作用的緣故[15]。

在星點設計試驗中，由于大黃與黃連劑量在變化，大黃、黃連有效成分的溶出也將會受到影響。若要同時考察大黃、黃連有效成分的溶出變化，則需要考慮的影響因素太多，限于篇幅有限，故本研究未展開研究。瀉心湯中黃芩瀉肺燥濕解毒，黃連瀉心清胃、燥濕解毒，大黃瀉火通肺瀉毒、引火下行。可見，黃芩、黃連與大黃都對瀉心湯的瀉火解毒這一功效有重要影響。因此，本研究將在后續研究中分別考察三者不同劑量配伍對大黃、黃連有效成分溶出變化的影響。

黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷的溶出率與配伍比例呈現非線性變化。當黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩、大黃、黃連的劑量分別為3、1.76、0.17 g時，黃芩苷、漢黃芩苷總溶出率較經典比例瀉心湯增加了47.21%，這可能會提高黃芩-大黃-黃連提取液的臨床療效。但是黃芩-大黃-黃連提取液的藥效不僅與其中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率有關，還需要對其他的有效成分進行測定及藥理試驗驗證，才能更深入地探究不同劑量配伍對黃芩-大黃-黃連提取液中有效成分的影響，這有待后續試驗進一步完善。

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（收稿日期：2017-08-21 修回日期：2017-10-08）

（編輯：林 靜）