當歸根、莖中總黃酮的提取工藝優化

羅旭東　李成義　李旭　強正澤　馮曉莉　王明偉　李碩　王燕

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0364-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.18

摘 要 目的：優化當歸根、莖中總黃酮的提取工藝。方法：以提取溶劑乙醇的體積分數、料液比、提取時間、提取次數等為考察因素，以提取液中總黃酮含量為評價指標，在單因素試驗基礎上采用Box-Behnken設計-響應面法優化當歸根、莖中總黃酮的回流提取工藝。結果：當歸根、莖中總黃酮最優提取工藝分別為乙醇體積分數70%、50%，料液比1 ∶ 40、1 ∶ 30，提取時間1.3、1.7 h，均提取2次；驗證試驗中總黃酮含量分別為7.253 6、25.144 1 mg/g（RSD=1.57%、1.49%，n=3），與模型預測值（6.942 8、25.703 5 mg/g）的相對誤差分別為4.28%、2.24%。結論：優化后的當歸根、莖中總黃酮的提取工藝方法簡單，重現性和可預測性較好。

關鍵詞 當歸；根；莖；總黃酮；單因素試驗；Box-Behnken設計；響應面法；回流提??；工藝優化

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize reflux extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of Angelica sinensis. METHODS： The reflux extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis was optimized by Box-Behnken design-response methodology based on single factor test using volume fraction of extraction solvent ethanol， solide-liquid ration， extraction time， extraction times as investigation factors， the content of total flavonoids in extract as evaluation index. RESULTS： The optimal extraction technology of total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis was that volume fractions of ethanol were 70% and 50%； solid-liquid ratios were 1 ∶ 40 and 1 ∶ 30； extraction time were 1.3 h and 1.7 h； The number of extraction times is two times. In verification test， the contents of total flavonoids were 7.253 6， 25.144 1 mg/g （RSD=1.57%， 1.49%， n=3）； relative errors of those to predicted value （6.942 8， 25.703 5 mg/g） were 4.28%， 2.24%. CONCLUSIONS： Optimized extraction technology for total flavonoids from the roots and stems of A. sinensis is simple， reproducible and predictable.

KEYWORDS Angelica sinensis； Roots； Stems； Total flavonoids； Single factor test； Box-Behnken design； Response methodology； Reflux extraction； Technology optimization

當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis （Oliv.）Diels]的干燥根，味甘、辛，性溫，能補血和血、調經止痛、潤燥滑腸，臨床上主要用于血虛萎黃、眩暈心悸、月經不調、經閉痛經、腸燥便秘等證[1]。當歸中主要含苯酞、黃酮、多糖、有機酸等多種類型的化學成分[2-4]，其中黃酮類化合物具有抗衰老、抗菌、保肝、降壓、抗癌、抗炎鎮痛、免疫調節等多種生物活性[5-9]，且其在人體內不能合成，只能外源性獲取[6]。因此，對黃酮類化合物活性成分的提取具有重要的研究價值。

當歸藥食兩用歷史悠久，歷代本草均對其有記載。經筆者調查發現，2014年甘肅岷縣當歸種植面積達1.01萬hm2，總產量2×107 kg左右[10]。但由于在傳統用藥習慣中，當歸僅以根入藥，故每年采收后當歸大量的地上部分被丟棄，不僅污染了產地環境而且造成了資源的極大浪費。已有研究表明，當歸地上部分中含有很多活性成分，如具有抗菌、抗凝血活性的金絲桃苷、綠原酸等成分[11-12]。近年來，對中藥資源進行合理利用并擴大其藥用部位等研究已被廣泛關注，但關于當歸地上部分莖總黃酮的提取和含量測定卻鮮見報道。

本研究以乙醇為提取溶劑，采用單因素試驗與Box-Behnken設計相結合的方法，以提取時間、料液比、乙醇的體積分數、提取次數等為考察因素，以總黃酮含量為評價指標，采用響應面法優化當歸根、莖中總黃酮的回流提取工藝，為當歸莖的綜合開發利用提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

UV-2401-PC型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）； BT25S型電子分析天平（精度：1/100 000）、 BT124S型電子分析天平（精度：1/10 000）均來源于北京賽多利斯儀器有限公司；DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱（北京市永興儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

采集甘肅岷縣十里鎮2016年10月初當歸根、莖（海拔：2 313.1 m，經度：104°0′ 10″ ，緯度：34°26′ 2″ ），經甘肅中醫藥大學李成義教授鑒定為傘形科植物當歸的根、莖；蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20771，純度：98%）；無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末2.0 g，用80%乙醇為溶劑，稱質量；回流提取1 h，取出，冷卻至室溫，稱質量并用80%乙醇補足減失的質量，過濾，濾液用80%乙醇定容于 100 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.2 標準曲線的制備 精確稱取干燥至恒質量的蘆丁對照品0.005 03 g，用75%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中。精密吸取0.5、1、2、2.5、4 mL，上述溶液置于10 mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻；靜置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，最后加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，加水至刻度，搖勻；靜置10 min，于510 nm波長下測吸光度。以吸光度為縱坐標（y）、蘆丁質量濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得方程y=6.254 1x-0.011 3（R2=0.999 6），表明蘆丁檢測質量濃度線性范圍為0.036 98～0.148 9 mg/mL。

2.1.3 精密度、穩定性、重復性和準確度試驗 精密吸取供試品溶液5 mL，按“2.1.2”項下方法操作后測定吸光度，連續測定6次，結果吸光度的RSD=1.06%（n=6），表明儀器精密度良好。分別取供試品溶液放置0、2、4、6、8、10、24 h后測定，結果總黃酮含量的RSD=2.38%（n=7），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1.2”項下方法操作后測定吸光度，結果吸光度的RSD=1.61%（n=6），表明該方法重復性良好。精密稱取已知含量的樣品粉末0.5 g，共6份，分別精密加入一定量的蘆丁對照品溶液（1 mg/mL），按“2.1.1”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1.2”項下方法測定，計算含量及回收率。結果，平均回收率為92.4%（RSD=2.35%，n=6），表明該方法準確度良好。

2.1.4 總黃酮含量的測定 精密吸取各供試品溶液5 mL，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，計算樣品中總黃酮的含量（mg/g）。

2.2 當歸根、莖中總黃酮提取工藝優化單因素試驗

筆者在前期試驗中發現，回流提取總黃酮含量較超聲提取法高，故本試驗采用回流提取法提取當歸根、莖中總黃酮。以料液比、乙醇體積分數、提取時間、提取次數為因素，考察各因素提取條件下的總黃酮含量。

2.2.1 乙醇體積分數 精密稱取當歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當歸根、莖料液比為1 ∶ 30，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1 h，考察不同體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇對當歸根中總黃酮含量的影響，結果見圖1A；同時，考察不同體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇對當歸莖中總黃酮含量的影響，結果見圖2A。

由圖1A、圖2A可知，隨著乙醇體積分數的增加，當歸根、莖中總黃酮含量呈上升趨勢，乙醇體積分數分別為80%、50%時總黃酮含量達到最高值，再增加乙醇體積分數而總黃酮含量呈下降趨勢，確定當歸根、莖中總黃酮提取時乙醇體積分數分別以80%、50%較優。

2.2.2 料液比 精密稱取當歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當歸根、莖提取時乙醇體積分數分別為80%、50%，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1 h，考察不同料液比（根： 1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40；莖：1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、 1 ∶ 30、1 ∶ 35）對當歸根、莖中總黃酮含量的影響，結果見圖1B、圖2B。

由圖1B、圖2B可知，隨著料液比的增加，當歸根、莖總黃酮含量呈上升趨勢，料液比分別為1 ∶ 35、1 ∶ 30時總黃酮含量達到最高值，再增加總黃酮含量變化微小，綜合考慮提取效率，確定當歸根、莖料液比分別為1 ∶ 35、 1 ∶ 30。

2.2.3 提取時間 精密稱取當歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當歸根提取時乙醇體積分數為80%、料液比1 ∶ 35，當歸莖提取時乙醇體積分數為50%、料液比1 ∶ 30；于80 ℃恒溫水浴中回流提取，考察不同提取時間（1、1.5、2、2.5、3 h）對當歸根、莖總黃酮含量的影響，結果見圖1C、圖2C。

由圖1C可知，隨著提取時間的增加，當歸根總黃酮含量呈先下降后上升趨勢，2.5 h達最大值，且提取時間為1、2.5 h時總黃酮含量差別較小，綜合考慮提取效率，確定當歸根提取時間為1 h。由圖2C可知，隨著提取時間的增加，當歸莖總黃酮含量呈上升趨勢，1、1.5 h呈急劇上升趨勢，隨提取時間的增加上升趨勢變緩，總黃酮含量增長幅度較小，綜合考慮提取效率，確定當歸莖提取時間為1.5 h。

2.2.4 提取次數 精密稱取當歸根、莖樣品粉末2.0 g，固定當歸根提取時乙醇體積分數為80%、料液比1 ∶ 35，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1 h；固定當歸莖提取時乙醇體積分數為50%、料液比1 ∶ 30，于80 ℃恒溫水浴中回流提取1.5 h，考察不同提取次數（1、2、3、4次）對當歸根、莖總黃酮含量的影響，結果見圖1D、圖2D。

由圖1D可知，隨著提取次數的增加，當歸根總黃酮含量呈上升趨勢，但隨提取次數的增加，總黃酮含量變化較小，為提高提取效率，確定當歸根提取次數為1次。由圖2D可知，隨著提取次數的增加，當歸莖總黃酮含量呈上升趨勢，提取2次時總黃酮含量急劇上升，繼續增加提取次數，總黃酮含量變化較小，綜合考慮，確定當歸莖提取次數為2次。

2.3 當歸根、莖中總黃酮提取工藝優化響應面試驗

2.3.1 試驗設計 在單因素試驗的基礎上，根據Box- Behnken設計原理，選取提取時間（X1）、料液比（X2）、乙醇體積分數（X3）3個因素為自變量，以所得總黃酮含量為響應值（Y），設計3因素5水平共20個試驗點的響應面分析試驗，其中14個析因試驗、6個中心試驗，并綜合單因素試驗結果確定零水平和波動區。試驗設計因素與水平見表1；設計與結果見表2。

2.3.2 模型建立與顯著性分析 采用分析軟件 Design- Expert 8.0.5對試驗數據進行回歸分析，得到多元二次回歸擬合方程如下：當歸根為Y=6.63+0.046X1+0.57X2-0.30X3+0.078X1X2+0.095X1X3+8.5×10-3X2X3-0.083X12-0.31X22-0.93X32；當歸莖為Y=25.16+0.16X1+1.22X2-0.51X3+0.1X1X2+0.30X1X3+0.087X2X3-0.22X12-0.82X22-1.03X32。方差分析結果分別見表3、表4。

由表3可知，該模型回歸（P=0.001 4<0.01）顯著，失擬項（P=0.067 2>0.05）不顯著，且該模型相關系數R2=0.881 6，說明該模型與試驗擬合良好，表明該模型擬合效果較好，可用此模型來分析和預測回流提取當歸根總黃酮的工藝條件。在各因素中，X2、X32極顯著，X22顯著，其余均不顯著；交互項無顯著影響。由F值大小可以判斷，在所選試驗范圍內，3 個因素的總黃酮含量影響排序為 X2>X3>X1。由表4結果可知，該模型回歸（P=0.000 8<0.01）顯著，失擬項（P=0.579 6>0.05）不顯著，且該模型R2=0.893 5，表明該模型擬合效果較好，可用此模型來分析和預測回流提取當歸莖總黃酮的工藝條件。在各因素中，X2、X22、X32高度顯著，X3顯著，其余均不顯著；交互項無顯著影響。由F值大小可以判斷，在所選試驗范圍內，3個因素的總黃酮含量影響排序為X2>X3>X1。

2.3.3 響應面法優化試驗 根據擬合模型繪制當歸根、莖中總黃酮的響應面圖，判斷最優參數及各參數之間的交互作用，以此確定最優工藝參數范圍，詳見圖3、圖4。

（1）X1-X2。由圖3A可知，當X3值一定、X2值不變時，Y值隨著X1的增加變化較小，曲線較為平坦；X1值不變時，Y值隨著X2值的增加而增加，到達一定程度后，隨著X2值的增加變化緩慢。當料液比為1 ∶ 30～1 ∶ 40時，總黃酮含量最高且幾乎不變。由圖4A可知，當X3值一定、X2值不變時，Y值隨著X1值的增加變化不大，曲線較為平坦；X1值不變時，Y值隨著X2值的增加而增加，到達一定程度后，隨著數值的增加變化緩慢。當X2值為1 ∶ 25～ 1 ∶ 35時，Y值最高且幾乎不變。

（2）X1-X3。由圖3B可知，當X2值一定時、X3值不變時，Y值隨著X1值的增加變化較小，曲線較為平坦；當X1值不變時，Y值隨著X3值的增加而增加，到達一定程度后，隨著X3值的增加反而下降。當X2值在58%～74%時，Y值最高且幾乎不變。根據相似相溶原理可知，當歸根總黃酮極性與此范圍體積分數乙醇溶液的極性相當。由圖4B可知，當X2值一定、X3值不變時，Y值隨著X1值的增加變化不大，曲線較為平坦；當X1值不變時，Y值隨著X3值的增加而增加，到達一定程度后，隨著X3值的增加反而下降。當乙醇體積分數在45%～55%時，Y值最高且幾乎不變。根據相似相溶原理可知，當歸莖總黃酮極性與此范圍體積分數乙醇溶液的極性相當。

（3）X2-X3。結果見圖3C、圖4C。由圖3C、圖4C可知，當X1值一定時，Y值隨X2值及X3值的增大均呈先增大后減小的趨勢，并從圖形走向趨勢看，X2值的影響效應更大。三者的交互作用與回歸方差分析結果一致。

從響應面圖可以判斷出最佳點均落在試驗考察區域內，根據所得到的模型，回流提取當歸根、莖總黃酮最優提取條件分別為乙醇體積分數67.53%、48.50%，料液比1 ∶ 39.9、1 ∶ 32.69，回流時間1.34、1.67 h。考慮到實際操作的可行性，將當歸根、莖總黃酮的提取工藝條件分別修正為乙醇體積分數70%、50%，料液比1 ∶ 40、1 ∶ 30，回流時間1.3、1.7 h。

2.4 驗證試驗

分別精密稱取3份當歸根、莖樣品各100.0 g，按上述修正的最優提取工藝進行驗證試驗，操作方法同前。結果，當歸根提取液的總黃酮含量為7.253 6 mg/g（RSD=1.57%，n=3），與理論預測值6.942 8 mg/g基本吻合（相對誤差為4.28%）。當歸莖提取液的總黃酮含量為25.144 1 mg/g（RSD=1.49%，n=3），與理論預測值25.703 5 mg/g基本吻合（相對誤差為2.24%）。

3 討論

在試驗前期，筆者曾采用80%乙醇提取當歸莖中總黃酮，結果提取液呈綠色，采用對提取液離心、活性炭吸附、石油醚萃取及石油醚索氏回流提取等方法去除葉綠素，效果均不理想。但在后續單因素試驗中發現，乙醇體積分數在50%時當歸莖總黃酮含量較高，且提取液為棕黃色，全波長掃描發現無葉綠素吸收峰，推測在此乙醇體積分數條件下葉綠素對總黃酮提取液影響較小。故確定提取當歸總黃酮時乙醇體積分數最低為50%，且由此簡化了試驗步驟。單因素試驗結果表明，當歸根總黃酮乙醇體積分數為70%，而當歸莖乙醇體積分數為50%，由此可推斷當歸根中黃酮極性較小，而當歸莖中黃酮極性較大。

目前，對當歸地上部分莖總黃酮提取工藝的研究文獻報道較少。Ben-Behnken設計-響應面法相對于正交試驗設計和均勻設計法具有預測性好、精確度高的特點，故本課題組采用單因素試驗與Ben-Behnken設計-響應面法相結合對當歸根、莖總黃酮提取工藝進行優化。驗證試驗結果發現實測值與預測值的相對誤差較小，表明采用響應面法所得優化條件穩定、可靠。另外，經比較發現，當歸莖中總黃酮含量約為根中總黃酮的3.24倍。故筆者認為應將當歸地上部分特別是莖部合理開發利用，在避免資源浪費的同時可增加經濟效益，由此還可提高當地藥農生產積極性。本研究結果為當歸地上部分莖的開發利用提供了參考依據。

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（收稿日期：2017-06-01 修回日期：2017-07-10）

（編輯：劉 萍）